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Correo Científico Médico de Holguín 2003;7(1)


Facultad de Ciencias Médicas “Mariana Grajales” Holguín.

 

Purificación de IgG de Conejo por cromatografía de Intercambio Iónico y de afinidad.

Purification of rabbit IgG  by  ion exchange and affinity  chromatography.

 

 Maritza Ulloa Román1, Beatriz Cruz Castellanos2, Elizabeth Guilarte Barinaga3, Tamahara Fernández Iglesias 4, Luis Escalona Fernández5 

 
1 Máster en Biotecnología. Profesora Auxiliar. Instituto Superior Pedagógico "José de la Luz y Caballero"
2 Lic. en Química. Laboratorio de Biotecnología CITMA. Holguín
3 Lic. en Química. Facultad de Ciencias Médicas "Mariana Grajales"
4 Máster en Didáctica de la Química. Asistente. Instituto Superior Pedagógico "José de la Luz y Caballero"
5 Máster en Didáctica de la Matemática. Asistente. Facultad de Ciencias Médicas "Mariana Grajales"

 

RESUMEN

 

La purificación de IgG de conejo es un paso importante durante la obtención de antisueros para uso clínico. En el presente trabajo se estudiaron  dos procedimientos  para realizar el proceso: la cromatografía de Intercambio iónico en DEAE-Celulosa y la cromatografía de afinidad en Proteína A- Sepharosa Fast Flow, ambos con previa precipitación con sulfato de amonio al 50 % de saturación. Se diseñó un experimento para la optimización de la purificación  de  IgG  mediante cromatografía de intercambio iónico obteniéndose como parámetros óptimos, los valores de 21 cm/h para la velocidad de flujo y un volumen de suero de 8 ml. Se obtuvieron resultados similares de pureza y recobrado para la cromatografía de afinidad y la de intercambio iónico, recomendándose esta última por su bajo costo y satisfactorios resultados para la utilización diaria en la purificación de IgG de conejo.

Descriptores: IgG de conejo, Antisueros, Purificación, Cromatografía.

 

ABSTRACTS

 

Purification of rabbit IgG is an important step for antiserum production for clinical use. In this paper, two procedures were studied: ion exchange chromatography using DEAE-Cellulose and affinity chromatography using Protein A- Sepharosa Fast Flow. Both experiments use a first step by means of ammonium sulfate precipitation. A factorial experiment was developed for the optimization of IgG purification from rabbit serum. Flow rate of 21 cm/h and serum 8 ml were selected as the best conditions for rabbit IgG purification. Similar results of recovery and purity were obtained in affinity chromatography and ion exchange chromatography. The last procedure is recommended by these results for usual rabbit IgG purification.

 Key words: Rabbit IgG, purification, chromatography, antiserum.

 

INTRODUCCIÓN

 

Durante la producción de antisueros se obtienen en el suero de los animales inmunizados, altos títulos de anticuerpos contra el antígeno empleado. Es la fracción de las IgG generalmente, la responsable fundamental de la respuesta inmune alcanzada.

Entre los métodos cromatográficos más empleados para la purificación de IgG  se encuentran la cromatografía de intercambio iónico (1,2,3) y la de afinidad (4,5) y, como caso particular de esta última, la cromatografía en proteína A -Sepha­rosa (6,7,8). . Por lo general se logran mejores resultados cuando se combinan diferentes métodos(7,9).El presente trabajo se encaminó hacia el montaje y optimización de técnicas que permitan contar con un método de trabajo para la purificación de IgG a partir de suero de conejo, económicamente factible y con un grado de pureza adecuado.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

 

Para la realización de nuestro trabajo se utilizaron sueros de conejo normal e inmunizado provenientes del Centro Provincial de Higiene y Epidemiología de Holguín.

Se trabajaron dos esquemas de purificación. El primero se realizó mediante la precipitación con sulfato de amonio al 50 % de saturación, posterior desalinización del precipitado me­diante diálisis  y  cromatografía de intercambio iónico en DEAE-Celulosa DE-52 (Wahtman), a partir de una modificación del método propuesto por Mayer (3).

El segundo, se inició igualmente con precipitación salina y diálisis y culmina con cromatografía de afinidad en Proteína A- Sepharosa Fast Flow (Pharmacia), adecuando el método propuesto para IgG de ratón (6).

Para la purificación de IgG de conejo por intercambio   iónico se realizó un experimento con un diseño factorial 2n   con el objetivo de optimizar la velocidad de flujo y el volumen de suero. Se realizaron 4 experimentos para los que se seleccionaron los valores máximos y mínimos de cada variable y cuyo orden de realización se determinó aleatoriamente (10). La tabla 1 muestra los datos de los valores utilizados durante la  realización de los experimentos.

Se hizo la cuantificación de proteínas por el método de Lowry (11) y como criterio de pureza se utilizó la inmunoelectro­foresis (1).

 

RESULTADOS

 

Una vez realizados los cuatro experimentos de purificación de IgG de conejo por cromatografía de intercambio iónico, para cada uno de ellos se obtuvo el gráfico de absorbancia contra volumen de elución de la columna que se muestra en la figura 1.

 En la tabla 1  se muestran los datos de cuantificación de proteínas en el suero y los picos para cada experimento, así como el recobrado obtenido en cada caso. Se puede observar que el mejor valor de recobrado se obtiene para el experimento 4. Se analizó la inmunoelectroforesis realizada a dicho pico y se encontró una sola banda de precipitación que corresponde por su migración a las IgG, obteniéndose resultados similares en cuanto a pureza en los diferentes experimentos.

La figura 2 muestra el cromatograma correspondiente a la purificación de IgG de suero de conejo normal mediante cromatografía de afinidad en Proteína A- Sepharosa Fast Flow. El primer pico corresponde a las proteínas no enlazadas que eluyen con el buffer inicial (Glicina 1,5 mol/l, NaCl 3 mol/l pH=8,9). La IgG de conejo eluye con el buffer citrato 0,1 mol/l  pH=4 que corresponde al segundo pico. El tercer pico contiene una pequeña fracción de IgG fuertemente enlazada a la columna y que se elimina al lavar la misma con buffer citrato pH=3.   Al comprobar la pureza de la IgG mediante la inmunoelectroforesis, se obtuvieron resultados similares a los anteriores con una sola banda de precipitación.

A continuación se aplicaron ambos métodos para la purificación de suero de un conejo que había sido inmunizado con suero de ratón para obtener IgG de conejo anti-ratón.

La tabla 2 muestra los resultados comparativos de estas dos purificaciones. Se puede observar que los valores de concentración de IgG en el pico, así como el recobrado obtenido son similares. De igual forma, mediante la inmunoelectroforesis  se comprobó la pureza de ambas con análogos resultados.

 

 Tabla 1.Comparación de los resultados de las corridas del experimento realizado para la cromatografía
de intercambio iónico en DEAE-Celulosa

 

  Orden de    Volumen       Velocidad             Concentración    Concentración    Recobrado

Ejecución        (ml)          (ml/min) (cm/h)         de proteína          de IgG           ( mg IgG

                                                                               en el suero          pico                 ml suero)

       (mg/ml)          (mg/ml)                                                          

 

         1               8               2,3        43,9                   71,18              0,674               0,107

 

         2             12               2,3        43,9                    71,18              0,980              1,980

 

         3             12               1,1        21,0                    71,18              0,840              2,100

 

         4               8               1,1        21,0                    71,18              0,702              3,950

 

                        

 

Tabla 2. Comparación de la purificación de IgG de conejo antiratón    por Cromatografía de

Intercambio Iónico  y de afinidad.

 

                                                 Cromatografía   Cromatografía

 

                                                    Inter. Iónico        Afinidad 

 

    Volumen de suero(ml)                     8                         5

     Conc. proteínas                          92,29                   92,29

     en suero (mg/ml)

     Conc. IgG pico                           1,66                      1,91

        (mg/ml)

     Recobrado                                  9,38                      9,58

     (mg IgG/ ml suero)

 

 

 

 

 

 

 

Figura 1. Gráfico de absorbancia (A) a 280 nm contra número de tubos obtenido para la purificación de IgG

de suero de conejo por cromatografía de intercambio iónico

 

 

 

 

 

Figura 2. Gráfico de absorbancia (A) a 280 nm contra número de tubos obtenido para la purificación

de IgG de suero de conejo por cromatografía de afinidad.

 

 

DISCUSIÓN

 

Al analizar los resultados obtenidos en los experimentos de purificación de IgG de conejo por cromatografía de intercambio iónico, se pudo comprobar que los mejores resultados en cuanto a recobrado y pureza se obtienen en el experimento 4 que se realizó para una columna de 40 g de DEAE-Celulosa DE-52 (Wahtman)  a la de velocidad de flujo de 1,1 ml/min (21 cm/h) y 8 ml de suero.

Esto se atribuye a que a bajas velocidades de flujo se logra mejor interacción de las sustancias a separar con el gel. El empleo de menor cantidad de suero impide que se saturen los centros activos de las resinas de intercambio  iónico lo que contribuye a lograr una mayor pureza de la IgG separada.

Los valores de recobrado y la pureza obtenidas para la Cromato­grafía de Intercambio Iónico en DEAE-Celulosa y de afinidad en proteína A- Sepharosa son similares en las condiciones utilizadas en el presente trabajo.

Debido al costo tan elevado de la matriz de Proteína A- Sepha­rosa y los resultados obtenidos para la purificación de IgG de conejo por cromatografía de intercambio iónico, resulta este último el método recomendado en nuestras condiciones de trabajo para la purificación habitual de los antisueros.


BIBLIOGRFÍA 

  1. Margni,R.A Inmunología e Inmunoquímica. 3ra edición. La Habana:  Ed Pueblo y Educación, 1982.
  2. Tanaka K, Sawatani E, Días GA, Shigueoka EM, Campos TC, Nakao HC, Arashiro F. High quality human immunoglobulin G purified from Cohn fractions by liquid chromatography. Braz J Med Biol Res 2000 ; 33(1): 27-30.
  3. Mayer, RJ, J.W.Walker. Immunochemical methods in Biological Sciences. Enzymes and Proteins. London. Academic Press Inc. 1980.
  4. Monoclonal antibody purification. Separation News. Pharmacia Uppsala, Sweden 1987; 13 (4).
  5. Qi Y., Yan Z., Huang J.. Chromatography on DEAE ion exchange and Protein G affinity columns in tandem for the separation and purification of proteins. J Biochem Biophys Methods  2001 Oct 30; 49(1-3):263-73.
  6. Specific monoclonal antibody purification techniques. The use of protein A Sepharose to purify murine IgG. Separation News.  Pharmacia, Uppsala Sweden. 1987: Vol 13 (5).
  7. Jiskoot W, Van Hertroij J, Hoven A M. Preparation of clinical grade monoclonal  antibody serum containing cells culture supernatants. J Immun Meth 1991; 138: 273-283.
  8. Sheoran AS., Lunn DP., Holmes MA.. Monoclonal antibodies to subclass-specific antigenic determinants on equine immunoglobulin gamma chains and their characterization. Vet Immunol Immunopathol  1998; 62(2): 153-65.
  9. Boschetti E. Antibody separation by hydrophobic charge induction chromatography. Trends Biotechnol  2002; 20(8): 333-7.
  10. López, R. Diseño estadístico de experimentos. La Habana: Editorial Científico Técnica. 1988.
  11. Lowry DM, Rosembrough NJ, Farr AL, Randal RJ. Protein  measurement with the Folin Phenol reagent. J Biol Chem 195; 265-269.

 

Correspondencia: Maritza Ulloa Román. Instituto Superior Pedagógico de Holguín.

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