Trabajo original

 

Meta-análisis del volumen nuclear de hepatocitos sometidos a diferentes condiciones de estrés.

 

Meta analysis of the nuclear volume of hepatocytes under different conditions of stress.

 

Pedro A. Díaz Rojas¹, Julio Sánchez Meca².

 

1. Profesor Titular. Departamento de Ciencias Morfológicas. Facultad de Ciencias Médicas de Holguín. Cuba.
2. Profesor Titular. Departamento de Metodología de Investigación en las Ciencias del Comportamiento. Facultad de Psicología. Universidad de Murcia. España.

 

RESUMEN

 

En este trabajo se presentan los resultados de un estudio meta-analítico sobre los efectos que la inducción de estrés provoca sobre el volumen nuclear de los hepatocitos. Una búsqueda exhaustiva de la literatura internacional nos permitió recoger 5 estudios experimentales, todos ellos realizados en Cuba en el período 1987 – 1996. Se definió como índice del tamaño del efecto la diferencia media tipificada, consistente en calcular para cada estudio la diferencia entre las medias en volumen nuclear de los grupos experimental y de control dividida por la desviación típica intragrupo. Se calculó un tamaño del efecto para cada área del lobulillo hepático clásico (cercano al espacio porta, en la zona media y cercano a la vena central, así como el volumen nuclear total). Los resultados muestran que la zona más sensible a los efectos del estrés es la zona media del lobulillo, produciéndose una significativa disminución en el volumen nuclear de los hepatocitos como resultado de la inducción del estrés. El efecto del estrés resulta más fuerte cuando se induce mediante fármacos que cuando se realiza hepatectomía, y en concreto cuando se utiliza como fármaco el fenobarbital. Finalmente se recomienda el uso de la fórmula de Palkovit para el cálculo del volumen nuclear, ya que ésta se muestra más sensible que la fórmula estereológica para detectar los cambios en el volumen nuclear de los hepatocitos.

 

Palabras claves: Estrés, hepatocitos, estudios de casos y controles, meta analysis.

 

ABSTRACT

 

A meta analytic study about the effects that stress induction provokes on the nuclear volume of hepatocytes is presented in this paper. An exhaustive  search in the international literature allowed us to gather 5 experimental studies, all of them developed in Cuba in the period 1987 – 1996.  The mean typified difference, consisting in calculating, for each study, the difference between the means in nuclear volumes of the experimental and control groups divided by the typical deviations within the groups was defined as the index of the magnitude of the effect. The magnitude of the effect for each area of the classic hepatic lobule (close to the porta space, in the medial zone and close to the central vain, as well as the total nuclear volume) was calculated. The zone most sensitive to the effects of stress is the central part of the lobule with a significant decrease in the nuclear volume of the hepatocytes as a result  of the induction of stress is shown in the results. The effect of stress is stronger when it is induced by drugs than when hepactectomy is carried out, mainly when phenobarbital is the drug used. Finally, the use of the Palkovit formula is recommended for the calculation of nuclear volume, since this is more sensitive than the stereologic formula to detect the changes in the nuclear volume of hepatocytes.

                    

Key words: Stress, hepatocytes,  case-control studies, meta analysis.

 

INTRODUCCIÓN

 

La obtención de indicadores microscópicos de estructuras tridimensionales hoy en día es uno de los problemas más estudiados en las ciencias biomédicas y biológicas. Los resultados alcanzados gracias a otras ciencias, muchas de las cuales nada tienen que ver con los elementos vivos, demuestran la existencia de un arsenal de métodos novedosos que permiten obtener estos indicadores a partir de la imagen plana del microscopio, utilizando para ello diversos tipos de testajes, técnicas y fórmulas matemáticas las que se agrupan en los llamados métodos morfométricos y estereológicos. Estos han permitido elevar el nivel de conocimientos sobre la estructura celular y tisular así como diversos procesos fisiológicos y patológicos a los que están sometidos  dichos elementos ^1-5.

Las nuevas consideraciones en relación con las unidades morfofuncionales del hígado que difieren de los lobulillos hepáticos clásicos, especialmente el acino hepático propuesto por Rappaport^6,7,  donde existen zonas que se diferencian por la calidad de los nutrientes que reciben,  las propuestas por Schwartz-arad y colaboradores que en varios estudios sobre edad de los hepatocitos, síntesis de ADN, proliferación celular y actividad metabólica, describen la existencia de dos compartimentos dentro del lobulillo hepático clásico que guarda concordancia con el acino hepático de Rappaport y que permite un mejor análisis de los procesos celulares que ocurren en este tipo de lobulillo, estos compartimentos se denominan progenitor y metabólico^8-11,  han permitido organizar el estudio de este órgano de una mejor forma.

El volumen del núcleo de los hepatocitos puede modificarse según el estadío celular, así encontramos que cada núcleo somático tiene un tamaño que depende del contenido de ADN y proteínas y se relaciona con la actividad funcional que posee en la interfase. El diámetro nuclear del hepatocito oscila entre 7 y 16 micrómetros y no es raro encontrar células con núcleos de gran tamaño, poliploides, cuyo número aumenta con la edad y alcanza hasta un 80 % en la vejez¹².

Normalmente las células hepáticas conservan la capacidad de división, aunque no lo hacen con frecuencia. Como es conocido el hígado posee poder regenerativo después de la extirpación o de daño a zonas importantes de su parénquima por lo que se ha escogido como un modelo experimental para estudiar el proceso de regeneración^13,14.

Cuando este órgano resulta dañado se desencadenan varios procesos que tienden a reproducir la regeneración fisiológica donde juega un papel importante la división celular. Ocurren procesos enzimáticos que resultan de vital importancia para que se produzca la división celular por lo que existe una estrecha relación con el equilibrio hormonal, metabólico y estructural de los tejidos y sus células. Se considera que algunos productos del catabolismo de las proteínas ejercen una acción mitogénica. Durante la destrucción de los tejidos y su transformación neoplásica se forman sustancias que desempeñan un papel determinado en la regeneración por vía mitótica así como  hoy se  sabe de la participación del fenómeno de apoptosis celular en este proceso ^15-19. Estudios sobre reparación celular en heridas de piel y del cristalino y sobre regeneración en hígado han permitido conocer la participación de inhibidores mitóticos específicos de tejidos, detectándose que el papel inhibitorio de dichos productos resulta suprimido ante la producción de una herida, por la liberación de activadores mitóticos tisulares en estas circunstancias²⁰. Diversas sustancias obtenidas de extractos embrionarios,  leucocitarios  y  tumorales  ejercen  influencia  favorable  sobre la mitosis ^21,22.

Se ha demostrado que el volumen nuclear puede depender de dos aspectos importantes: el primero de ellos es la suma del contenido de ADN, proteínas y jugo nuclear, y el segundo el aumento exclusivo de proteínas y jugo nuclear²³, esto traduce dos estadios importantes que pueden definirse como la etapa en la cual el núcleo se prepara para la división celular y la etapa en que el núcleo dirige una intensa actividad metabólica celular respectivamente^24,25.

 

Objetivos del meta-análisis.

 

La respuesta hepática frente a un estrés debe verse modificada en función de un conjunto de factores que pueden o no estar estrechamente relacionados y presentes en el proceso de experimentación, de esta manera un factor importante a estudiar sería el tipo de estrés a que ha sido sometido el animal y, dentro de éstos, las vías por las cuales se produce. De igual forma, pueden existir otros elementos de interés, de entre los que se encuentran indicadores operativos propios de  la experimentación como el procesamiento tisular o las herramientas morfométricas empleadas en la obtención de los indicadores.

La importancia del conocimiento por parte de los investigadores de los factores que pueden modificar los resultados de los estudios morfométricos en el contexto de la experimentación animal ha sido el objetivo esencial del presente trabajo meta-analítico, basado en un conjunto de estudios realizados al respecto en nuestro laboratorio.

 

MÉTODO

 

Selección de los estudios.

Para la localización de los estudios se aplicaron dos procedimientos de búsqueda bibliográfica. En primer lugar, se consultó la base informatizada Medline con las palabras clave “nuclear volume and hepatocyte”, definiéndose el período temporal del 1987 al 1999.  En segundo lugar, se realizó una búsqueda informal de las investigaciones publicadas y no publicadas llevadas a cabo en Cuba durante el mismo período de tiempo.

 

Criterios de inclusión de los estudios.

 

Los criterios que tenían que cumplir los estudios para ser incluidos en le meta-análisis fueron los siguientes:

 

·        El estudio debía haber sido realizado o publicado en el período temporal 1987-1999.

·        El estudio tenía que ser  empírico con animales de experimentación utilizados en laboratorio y básicamente ratones.

·        Debía de incluir un grupo experimental y un grupo de control, donde el grupo experimental es expuesto a algún tipo de estrés que afecte el funcionamiento hepático.

·        El estudio debía incluir alguna medida cuantitativa del volumen nuclear de los hepatocitos y especificar el tipo de fórmula empleada para su obtención.

·        Debía contener los datos estadísticos pertinentes para la estimación del tamaño del efecto.

·        El estudio empírico debía tener como objetivo comprobar el influjo sobre el volumen nuclear de los hapatocitos a causa de determinado estrés al que hayan sido sometidos los animales de experimentación.

·        Debía aportar los datos del volumen nuclear de los hepatocitos según las diferentes zonas del lobulillo hepático clásico.

 

Resultado de la búsqueda.

 

A través de la búsqueda informal de los trabajos realizados en Cuba se encontraron cuatro  informes de investigación que permitieron definir 5 estudios independientes. Del proceso de búsqueda en Medline tan sólo se identificaron 2 estudios que parecían cumplir con los criterios de inclusión, de los cuales uno de ellos no se logró recuperar y el segundo quedó excluido por no incorporar medidas de volumen nuclear de los hepatocitos. Por tanto, la base de estudio meta-analítica estuvo formada  por  5 estudios recogidos en cuatro informes de investigación^26-29.

 

Codificación de las variables.

 

Con objeto de comprobar si la variabilidad de los estudios podía deberse a características diferenciales entre ellos se registraron las siguientes variables moderadoras:

·        Fuente de publicación (1: publicado; 2: no publicado).

·        Fecha de realización del estudio (año).

·        Tipo de estrés inducido (1: hepatectomía; 2: fármaco).

·        Tipo de fármaco (1: fenobarbital; 2: citosol).

·        Tipo de animal de experimentación (1:IOR, 2:BALC).

·        El número de núcleos medidos.

·        El número de campos medidos.

·        La fórmula empleada en el cálculo del volumen.

 

                             1. Vn = 1.04 p ab Öab;       2. Vn = Pc/Pt Vc,

 

Siendo a el diámetro menor, b el diámetro mayor, Pc los puntos contados, Pt los puntos totales del sistema de test y Vc el volumen de referencia.

 

En el apéndice 1  registramos el modelo de protocolo utilizado para la codificación de las variables de los estudios.

 

Cálculo del tamaño del efecto.

 

Dado que el objetivo del meta-análisis era comprobar el efecto que la inducción de estrés ejerce sobre el volumen nuclear de los hepatocitos se definió como índice del tamaño del efecto la diferencia media tipificada ³⁰:

                         d = Y_E – Y_C / S,

 

siendo Y_E e Y_C el volumen nuclear medio de los grupos experimentales y control respectivamente, y S la desviación típica conjunta definida como:

             

                                                 (n_E  -  1) (S_E)² + ( n_C  -  1) (S_C)²

                               S =    Ö    ----------------------------------------,

                                                       n_E  +  n_C   -  2

 

siendo n₀ y n_C los tamaños muestrales de los grupos experimental y control,  S_E² y S_C² las varianzas respectivas.

 

Dado que el índice d es un estimador sesgado del tamaño del efecto en la población, este debe corregirse mediante³⁰:

 

                                 d^c  =  c(m)d

 

donde c(m) es el factor de corrección del sesgo, que se obtiene mediante

 

                                                              3

                                   c(m)  =  1 -   -------------

                                                         4m  -  1

 

siendo      m =  n_E  +  n_C  -  2.

 

Valores positivos de d_C suponen que el grupo experimental presenta un volumen nuclear de los hepatocitos en promedio superior al del grupo de control. Valores negativos implican lo contrario y valores cero suponen un volumen nuclear similar en ambos grupos.

A partir de cada estudio se calculó la diferencia media tipificada para cada zona del lobulillo hepático clásico y de forma global. Así pues, se obtuvieron en cada estudio cuatro índices del tamaño del efecto:

Volumen Nuclear Total.

Volumen Nuclear en la Zona cercana al Espacio Porta.

Volumen Nuclear en la Zona Media (entre el espacio porta y la vena central).

Volumen Nuclear en la Zona cercana a la Vena Central.

 

En todos los estudios los cálculos de la diferencia media tipificada se realizaron a partir de las medias, desviaciones típicas y tamaños muestrales reportados en los mismos.

 

Análisis estadístico.

 

En primer lugar se describirán las características de los estudios meta-analizados en función de las diversas variables moderadoras registradas. El paso siguiente será analizar el tamaño del efecto según el modelo de Hedges y Olkin³⁰  en las siguientes fases:

 

Análisis descriptivo de la diferencia media tipificada en cada una de las zonas (media, media ponderada, mediana, cuartiles, etc.).

Estimación por intervalo del tamaño del efecto medio ponderado (nc=95%).

Comprobación de la homogeneidad de los tamaños del efecto en torno a su media.

Si el supuesto de homogeneidad no se cumple, búsqueda de variables moderadoras influyentes en los tamaños del efecto aplicando métodos de estimación por mínimos cuadrados ponderados.

 

Tabla 1. Descripción de las características de los estudios.

 

Variable                                                         Frecuencia          %

·         Fuente         Publicados                                             3                  60              No publicados                                        2                40   ·         Fecha     1987                                                            1                  20           1988                                                            1                  20           1993                                                            2                  40           1996                                                            1                  20   ·         Tipo de estrés:                  Hepatectomía                                        2                 40                  Fármaco                                                 3                  60   ·         Tipo de fármaco:                  Fenobarbital                                           1                33.3                  Citosol                                                    2                 66.7   ·         Tipo de animal:                  Ratón IOR                                              4                 80                  Ratón BalC                                             1                 20   ·         Número de núcleos medidos:                        300                                                    2                40                        750                                                    3                60   ·         Número de campos medidos:                        10                                                      2                40                        25                                                      3                60   ·         Fórmula del volumen empleada:                       Fórmula 1.                                          3                60                       Fórmula 2.                                          2                40

 

 

RESULTADOS

 

Descripción prototípica  de los estudios.

 

En el apéndice 2 se recoge la base de datos meta-analítica sobre la que se han realizado todos los análisis. Los estudios incluidos en el meta-análisis se caracterizan en términos generales por ser estudios en su mayoría publicados (60 %) realizados en 1993 (40  %).  El tipo de estrés inducido es mediante fármaco con mayor frecuencia (60 %) y en concreto citosol (66.7 %).  El número de núcleos medidos ha sido en mayor proporción de 750 (60 %) y el número de campos estudiados 25 (60 %). Aplicándose la fórmula del volumen de Palkovit (F-1) en 3 estudios (60 %). Finalmente, el tipo de animal utilizado fue el ratón línea IOR (80 %). En la tabla 1 se presenta una descripción de las características de los estudios.

 

Distribución del tamaño del efecto medio.

 

Todos los cálculos están basados en un total de 379 animales sometidos a condiciones de estrés y 379 animales que formaron parte de los grupos de control. Recordamos que el índice del tamaño del efecto utilizado fue la diferencia media tipificada entre los dos grupos. Los resultados para las cuatro zonas donde se realizó la medición (cercana al área porta, en la zona media, cercana a la vena central y total, que representa el promedio de las anteriores) se presentan en la tabla 2.

 

Tabla  2.  Indicadores del tamaño del efecto del volumen  nuclear de hepatocitos sometidos

                a diferentes condiciones de estrés para cada zona de medición.

ESTADISTICO	VOLUMENTOTAL	VOLUMEN EN PORTA	VOLUMEN EN MEDIA	VOLUMEN EN CENTRAL
K	5	5	5	5
NO. ANIMALES EN ESTUDIO	379	379	379	379
NO. ANIMALES EN CONTROL	379	379	379	379
MEDIA	- 0.675	- 0.268	- 1.632	- 0.301
MEDIA POND.	- 0.232	0.046	- 0.701	- 0.096
MEDIANA	- 0.141	- 0.033	- 2.225	- 0.184
MINIMO	- 2.066	- 1.261	- 3.000	- 1.179
MAXIMO	0.483	0.607	- 0.081	0.498
CUARTIL  1	- 1.877	- 0.817	- 2.550	- 1.027
CUARTIL  3	0.227	0.165	- 0.301	0.389
IC AL 95 %	-0.374  ; -0.090	-0.093 ; 0.185	-0.849 ; -0.553	-0.235 ; -0.043
Pr. HOMOGEN.	120.119	70.459	170.940	64.960
PROP. d+	2/5 = 0.40	2/5 = 0.40	0/5 = 0.00	2/5 = 0.40

 

El tamaño del efecto medio alcanzado sobre el total de las mediciones fue de -0.232

Lo que significa en concreto una disminución del volumen nuclear en los hepatocitos de los animales que sufren estrés respecto a los grupos controles. Vemos que este resultado se obtiene de igual forma en las áreas media y de la vena central, con tamaños del efecto medios de –0.701 y –0.096, respectivamente. Además los intervalos de confianza en torno a dicho tamaño del efecto medio no contienen el valor cero, lo que supone una clara disminución del volumen nuclear medio de los hepatocitos en los grupos de animales sometidos a estrés y los grupos controles. Por el contrario, las mediciones realizadas en la zona del espacio porta alcanzan un tamaño del efecto medio de 0.046, con un intervalo de confianza que incluye el valor cero (-0.093, 0.185). En consecuencia, las mediciones realizadas en la zona del espacio porta muestran que la inducción del estrés en los animales de experimentación no provoca diferencias en el volumen nuclear medio de los hepatocitos respecto a los grupos de control.

 

Los tamaños del efecto medio que acabamos de interpretar solo serán representativos del conjunto de estudios si éstos son homogéneos en torno a dicho promedio. Para comprobar este supuesto aplicamos la prueba de homogeneidad a cada una de las mediciones y, como se puede observar en la tabla 2, todas resultaron estadísticamente significativas (p < 0.001). En consecuencia, se hace preciso la búsqueda de variables o características de los estudios que puedan explicar dicha variabilidad.

Búsqueda de variables moderadoras.

 

Para realizar los análisis, evaluaremos el comportamiento de las variables moderadoras según la zona del tejido estudiado. Los resultados de los análisis estadísticos se presentan en las tablas 3-8 y en las figuras 1-9.

 

Tabla  3. Análisis de regresión por minimos cuadrados.

 

VARIABLE	K	C. REGR	QR	R2aj	QE	GL	QT	R2
VOLUMEN    NUCLEAR    TOTAL
FECHA	5	-0.040	1.871	0.000	118.248***	3	120.119	0.016
NUCLEOS	5	0.001	3.444	0.000	116.675	3	120.119	0.029
CAMPOS	5	0.022	3.444	0.000	116.675	3	120.119	0.029
VOLUMEN    NUCLEAR   EN AREA PORTA
FECHA	5	0.060	4.894*	0.000	65.565***	3	70.459	0.069
NUCLEOS	5	0.002	21.786***	0.079	48.673***	3	70.459	0.309
CAMPOS	5	0.054	21.786***	0.079	48.673***	3	70.459	0.309
VOLUMEN    NUCLEAR   EN AREA MEDIA
FECHA	5	0.203	35.077***	0.000	135.863***	3	170.940	0.205
NUCLEOS	5	0.004	89.408***	0.364	81.532***	3	170.940	0.523
CAMPOS	5	0.132	89.408***	0.364	81.532***	3	170.940	0.523
VOLUMEN    NUCLEAR   EN AREA DE LA VENA CENTRAL
FECHA	5	-0.037	1.778	0.000	63.181***	3	64.959	0.027
NUCLEOS	5	0.000	0.955	0.000	64.004***	3	64.959	0.015
CAMPOS	5	0.011	0.955	0.000	64.004***	3	64.959	0.015

K: N^o de estudios. C. REGR.: Coeficiente de regresión. Q_R: Suma de cuadrados debida a la regresión

que se distribuye según X₁².  R²_aj: Coeficiente de determinación ajustado. Q_E: Suma de cuadrados

de error que se distribuye según X²_k-2.  GL: Grados de libertad de Q_E. Q_T: Suma de cuadrados total

que se distribuye según X²_k-1. R²: Coeficiente de determinación no ajustado.

 

Tabla  4. Análisis de regresión por mínimos cuadrados ponderados.

 

VARIABLE	K	C. REGR	QE	R2aj	QE	GL	QT	R2
VOLUMEN    NUCLEAR    TOTAL
FUENTE	5	-0.383	4.411**	0.000	115.708***	3	120.119	0.037
ESTRÉS	5	-0.998	48.411***	0.193	72.708***	3	120.119	0.395
FARMACO	3	1.598	32.551***	0.000	39.050***	1	71.609	0.455
ANIMAL	5	-1.991	54.746***	0.274	65.373***	3	120.119	0.456
FORMULA	5	0.983	37.144***	0.079	82.975***	3	120.119	0.309
VOLUMEN    NUCLEAR   EN AREA PORTA
FUENTE	5	-0.586	11.800**	0.000	58.659***	3	70.459	0.167
ESTRÉS	5	-0.718	25.263***	0.145	45.196***	3	70.459	0.358
FARMACO	3	0.671	7.695**	0.000	30.510***	1	38.205	0.201
ANIMAL	5	-0.966	17.695***	0.001	52.764***	3	70.459	0.251
FORMULA	5	1.049	47.402***	0.564	23.057***	3	70.459	0.673
VOLUMEN    NUCLEAR   EN AREA MEDIA
FUENTE	5	-2.170	100.972***	0.454	69.968***	3	170.940	0.591
ESTRÉS	5	-0.483	10.172***	0.000	160.768***	3	170.940	0.059
FARMACO	3	2.346	52.551***	0.000	54.083***	1	106.639	0.493
ANIMAL	5	-2.451	60.981***	0.142	109.959***	3	170.940	0.357
FORMULA	5	2.366	165.952***	0.958	5.347	3	170.940	0.969
VOLUMEN    NUCLEAR   EN AREA DE LA VENA CENTRAL
FUENTE	5	-0.241	1.917	0.000	63.042***	3	64.959	0.029
ESTRÉS	5	-0.937	43.254***	0.972	21.705***	3	64.959	0.666
FARMACO	3	0.803	10.356***	0.000	11.151***	1	21.507	0.481
ANIMAL	5	-1.202	25.494***	0.810	39.465***	3	64.959	0.392
FORMULA	5	0.629	16.901***	0.013	48.058***	3	64.959	0.260

K: N^o de estudios. C. REGR.: Coeficiente de regresión. Q_R: Suma de cuadrados debida a la regresión

que se distribuye según X₁².  R²_aj: Coeficiente de determinación ajustado. Q_E: Suma de cuadrados

de error que se distribuye según X²_k-2.  GL: Grados de libertad de Q_E. Q_T: Suma de cuadrados total

que se distribuye según X²_k-1. R²: Coeficiente de determinación no ajustado.

 

Volumen nuclear total.

 

Comenzando con la medición global, se observa un efecto significativo del tipo de estrés inducido en los animales  [Q_R(1)= 48.411, p<0.001](Ver tablas  4 - 5 y figura 1). En concreto, cuando el estrés se induce por hepatectomía, que implica pérdida de masa hepática, se produce un incremento del volumen nuclear medio de los hepatocitos (tamaño del efecto medio 0.290); sin embargo, cuando el estrés se induce mediante fármaco, que no supone pérdida de masa hepática y sí daño tisular, el volumen nuclear medio de los hepatocitos se reduce significativamente respecto de los controles (tamaño del efecto medio –0.78).

 

Tabla  5.  Tamaños del efecto medios según las categorías de  las variables

                    moderadoras cualitativas en el volumen   nuclear total.

VAR / CAT	K	d+	INTERVALO DE CONFIANZA       Li                             Ls
FUENTE
PUBLICADA	3	-0.157	-0.316	0.001
NO PUBLICADA	2	-0.541	-0.861	-0.220
ESTRÉS
HEPATECTOMIA	2	0.290	0.084	0.496
FARMACO	3	-0.708	-0.904	-0.512
FARMACO
FENOBARBITAL	1	-2.066	-2.573	-1.560
CITOSOL	2	-0.468	-0.681	-0.255
ANIMAL
IOR	4	-0.076	-0.224	0.072
BalC	1	-2.066	- 2.573	1.560
FORMULA
F-1	3	-0.941	-1.209	-0.672
F-2	2	0.043	-0.125	0.210

K: Número de estudios.  d₊: Tamaño del efecto medio. Ls y Li: Límites confidenciales

superior e inferior.

 

Centrándonos en los estudios que utilizaron algún tipo de fármaco para inducir el estrés, hemos encontrado un efecto significativo según que se utilice fenobarbital o citosol regenerativo [Q_R(1)= 32.551, p<0.001](ver tablas 4-5 y figura 1). En concreto, se produce una reducción del volumen nuclear medio más drástica cuando usamos un citotóxico como el fenobarbital (tamaño del efecto medio –2.066) que cuando se utiliza citosol regenerativo (tamaño del efecto medio –0.468), si bien también en este último caso la reducción del volumen nuclear medio es estadísticamente significativa, ya que el  intervalo de confianza no contiene el valor cero.

 

 

Figura 1. Tamaños del efecto medios para las categorías de las variables
cualitativas en volumen nuclear total.

 

Por otra parte, la fórmula utilizada para el cálculo del volumen nuclear medio afecta a los resultados obtenidos [Q_R(1)= 37.144, p<0.001](ver tablas 4-5 y figura 1), siendo la fórmula de Palkovit la que permite reflejar el cambio en el volumen nuclear medio experimentado (tamaño del efecto medio –0.941), mientras que con la fórmula estereológica (f-2) no se logra detectar los cambios producidos en el volumen nuclear de los hepatocitos (tamaño del efecto medio 0.043).

 

El tipo de animal también parece afectar a los resultados [Q_R(1)= 54.746, p<0.001] (ver tabla 4-5 y figura 1), siendo el tipo BalC el que presenta los cambios más drásticos en el volumen nuclear medio. No obstante, es preciso apuntar que el único estudio con este tipo de animal se corresponde precisamente con el único estudio que utilizó fenobarbital y, en consecuencia, la diferencia hallada en los dos tipos de animal puede deberse al tipo de fármaco.

 

En cuanto a la fuente de publicación, se observan diferencias significativas entre los estudios publicados y los no publicados [Q_R(1)= 4.411, p<0.01] (ver tablas 4, 5 y figura 1). Paradójicamente, los estudios no publicados presentan un tamaño del efecto más fuerte que los publicados (-2.561). Uno de los estudios no publicados fue precisamente el que utilizó fenobarbital.

 

Otras variables que no han afectado a los resultados, en cuanto al volumen nuclear total, fueron la fecha de realización del estudio, el número de núcleos y el número de campos medidos (ver tabla 3).

 

Volumen nuclear en el Área  en  el Espacio Porta.

 

Centrándonos en las mediciones realizadas en el área del espacio porta, encontramos que el tipo de estrés es una variable influyente en los resultados [Q_R(1)= 25.263, p<0.001] (ver tablas 4, 6 y figura 2). En concreto, el estrés inducido mediante hepatectomía produce un incremento significativo del volumen nuclear medio (tamaño del efecto medio 0.441), mientras que el uso de fármaco supone una disminución del volumen nuclear medio (tamaño del efecto medio –0.277).

 

Tabla  6.  Tamaños del efecto medios según las categorías  de  las variables

                  moderadoras cualitativas en el volumen   nuclear del espacio porta.

VAR / CAT	K	d+	INTERVALO DE CONFIANZA       Li                             Ls
FUENTE
PUBLICADA	3	0.176	0.018	0.334
NO PUBLICADA	2	-0.410	-0.704	-0.115
ESTRÉS
HEPATECTOMIA	2	0.441	0.233	0.649
FARMACO	3	-0.277	-0.464	-0.089
FARMACO
FENOBARBITAL	1	-0.817	-1.242	-0.392
CITOSOL	2	-0.146	-0.355	0.063
ANIMAL
IOR	4	0.149	0.002	0.297
BalC	1	-0.817	-1.242	-0.392
FORMULA
F-1	3	-0.667	-0.913	-0.421
F-2	2	0.381	0.212	0.550

K: Número de estudios.  d₊: Tamaño del efecto medio. Ls y Li: Límites confidenciales

superior e inferior.

 

 

Figura 2. Tamaños del efecto medios para las categorías de las variables
cualitativas en volumen nuclear cercano al espacio porta.

 

En cuanto al tipo de fármaco, se observan también diferencias significativas entre el uso del fenobarbital y citosol [Q_R(1)= 7.695, p<0.01] (ver tablas 4, 6 y figura 2). El fenobarbital provoca una significativa disminución del volumen nuclear (tamaño del efecto medio –0.817), mientras que el citosol  no parece influir significativamente sobre el volumen nuclear, si bien el tamaño del efecto medio alcanzado es negativo (-0.146).

 

 

Figura 3. Diagrama de dispersión de los tamaños del efecto en función de
la cantidad de núcleos medidos en el volumen cercano al área porta.

 

Figura 4. Diagrama de dispersión del tamaño del efecto en función de
la cantidad de campos en el volumen cercano al área porta.

 

Otras dos variables relacionadas con la manipulación experimental que parecen influir significativamente sobre los resultados son el número de núcleos y de campos medidos. Dado que estas dos variables están perfectamente correlacionadas, su significación estadística es idéntica [Q_R(1)= 21.786, p<0.001] (ver tabla 3, figuras 3 y 4). Según se observa en la figura 3, cuando la cantidad de núcleos medidos es de 300 encontramos un estudio con un tamaño del efecto nulo y otro estudio con un tamaño del efecto claramente negativo. Probablemente ello se deba a que en el primer estudio el estrés fue la hepatectomía y en el segundo el citosol. Una interpretación similar se puede hacer en cuanto al número de campos medidos, tal y como se muestra en la  figura 4.

 

El tipo de fórmula es un factor que influye en los resultados [Q_R(1)= 47.402, p<0.001] (ver tablas 4, 6 y figura 2). En este caso, con la fórmula de Palkovit se obtiene una significativa reducción del volumen nuclear (tamaño del efecto medio –0.667), mientras que con la fórmula estereológica se produce un incremento significativo del volumen nuclear (tamaño del efecto medio 0.381).

 

En cuanto al tipo de animal utilizado, encontramos también un efecto significativo [Q_R(1)= 17.695, p<0.001] (ver tablas 4, 6 y figura 2). Los cuatro estudios que utilizaron ratón línea IOR arrojan un tamaño del efecto medio de 0.149, lo que supone un incremento significativo del volumen nuclear medio. El único estudio que utilizó ratones BalC obtuvo un tamaño del efecto de –0.817, provocando una disminución significativa del volumen nuclear, un resultado probablemente debido a que éste fue el estudio que utilizó fenobarbital como fuente de estrés.

 

Volumen nuclear en la zona media.

 

Los resultados de los análisis se presentan en las tablas 2, 3, 4 y 7 y en las figuras 5, 6, 7 y 8.

 

Figura 5. Tamaños del efecto medios de las categorías de las variables
moderadoras cualitativas del volumen nuclear en la zona media.

 

Según se observa en la tabla 2, la zona del lobulillo hepático  más sensible a los cambios producidos por el estrés sobre el volumen nuclear es la media, siendo precisamente esta zona la de mayor actividad metabólica, con un tamaño del efecto medio de –0.701. En consecuencia, centraremos nuestro análisis de las variables moderadoras en dicha zona, en concreto, en el tipo de estrés inducido y en el tipo de fármaco, ya que son variables que modifican de forma relevante el funcionamiento de los hepatocitos y, por tanto, es esperable que modifiquen su volumen nuclear. Además analizaremos el posible efecto del tipo de fórmula utilizada para obtener el volumen nuclear, ya que pueden poseer una sensibilidad diferente para detectar dichos cambios con una mayor eficiencia.

 

Los estudios integrados en nuestro meta-análisis utilizaron dos tipos de estrés: mediante hepatectomía y mediante el suministro de un fármaco. El tipo de estrés afectó significativamente al volumen nuclear de los hepatocitos [Q_R(1)= 10.172, p<0.001] (ver tablas 4, 7 y figura 5). Aunque con ambos tipos de estrés se produce una disminución significativa del volumen nuclear medio de los hepatocitos, dicha disminución es mucho más fuerte cuando se aplican fármacos (tamaño del efecto medio –0.931) que cuando se efectúa una hepatectomía (tamaño del efecto medio –0.448).

 

Tabla 7.  Tamaño del efecto medios según las categorías de  las variables

                moderadoras cualitativas en el volumen nuclear de la zona media.

VAR / CAT	K	d+	INTERVALO DE CONFIANZA       Li                             Ls
FUENTE
PUBLICADA	3	-0.391	-0.551	-0.231
NO PUBLICADA	2	-2.561	-2.952	-2.169
ESTRÉS
HEPATECTOMIA	2	-0.448	-0.663	-0.233
FARMACO	3	-0.931	-1.136	-0.726
FARMACO
FENOBARBITAL	1	-3.000	-3.596	-2.404
CITOSOL	2	-0.654	-0.872	-0.436
ANIMAL
IOR	4	-0.550	-0.703	-0.397
BalC	1	-3.000	-3.596	-2.405
FORMULA
F-1	3	-2.557	-2.876	-2.238
F-2	2	-0.191	-0.358	-0.024

K: Número de estudios.  d₊: Tamaño del efecto medio. Ls y Li: Límites confidenciales

superior e inferior.

 

Al  centrar nuestra atención en los estudios que han inducido el estrés mediante algún fármaco, encontramos que existen diferencias significativas entre la aplicación de fenobarbital y el uso de citosol regenerativo sobre el volumen nuclear medio [Q_R(1)= 52.551, p<0.001] (ver tablas 4, 7 y figura 5). En concreto, ambos fármacos provocan una reducción significativa del volumen nuclear de los hepatocitos, pero dicha reducción es mucho más fuerte cuando se administra fenobarbital  (tamaño del efecto medio –3.000) que cuando se administra el citosol (tamaño del efecto medio –0.654).

 

Además del tipo de estrés y del tipo de fármaco, analizamos el posible influjo que sobre los resultados de los estudios puede ejercer el tipo de fórmula utilizada para calcular el volumen nuclear de los hepatocitos. Nuestra sospecha inicial se confirmó al encontrar resultados significativos en dicha variable [Q_R(1)= 165.952, p<0.001] (ver tablas 4, 7 y figura 5), ascendiendo al 95.8 % su porcentaje de varianza explicada  y siendo la variable que más varianza explica sobre los resultados del volumen nuclear. La relevancia de esta variable queda justificada aún más si tenemos en cuenta que la prueba Q_E para comprobar la especificación del modelo resultó no significativa [Q_E(1)= 5.347, p>0.05]. De las dos fórmulas empleadas por los investigadores, la que se muestra más sensible para detectar los cambios morfométricos en el núcleo de los hepatocitos, en este caso el volumen nuclear provocado por algún tipo de estrés, es la fórmula de Palkovit, con un tamaño del efecto medio de –2.557, siendo menos sensible la fórmula estereológica, con un tamaño del efecto medio de –0.191.

 

Figura 6. Diagrama de dispersión del tamaño del efecto en función
de la cantidad de núcleos en el volumen del área media.

 

 

Figura 7. Diagrama de dispersión del tamaño del efecto en función
de la cantidad de campos en el volumen del área media.

 

  

Figura 8. Diagrama de dispersión del tamaño del efecto en función de la
fecha de realización del estudio en el volumen del área media.

 

Volumen nuclear en la zona de la vena central.

 

Los resultados se muestran en las tablas 3, 4, 8 y la figura 9.  Se aprecian resultados muy similares a los obtenidos cuando las mediciones se realizaron en el área del espacio porta. En especial, se observa la misma tendencia en signo y magnitud de los tamaños del efecto medio para las categorías de las diversas variables moderadoras analizadas (tipo de estrés, tipo de fármaco, tipo de fórmula, tipo de animal y tipo de publicación). Por lo que remitimos al lector  a la sección anterior para una interpretación de los resultados.

 

Tabla 8.  Tamaño del efecto medios según las categorías de  las variables

               moderadoras cualitativas en el volumen   nuclear de la zona de la vena central.

VAR / CAT	K	d+	INTERVALO DE CONFIANZA       Li                             Ls
FUENTE
PUBLICADA	3	-0.046	-0.202	0.111
NO PUBLICADA	2	-0.287	-0.589	0.016
ESTRÉS
HEPATECTOMIA	2	0.416	0.209	0.623
FARMACO	3	-0.521	-0.709	-0.333
FARMACO
FENOBARBITAL	1	-1.180	-1.622	-0.737
CITOSOL	2	-0.377	-0.584	-0.169
ANIMAL
IOR	4	0.022	-0.125	0.186
BalC	1	-1.180	-1.622	-0.737
FORMULA
F-1	3	-0.528	-0.777	-0.280
F-2	2	0.100	-0.067	0.268

K: Número de estudios.  d₊: Tamaño del efecto medio. Ls y Li: Límites confidenciales

superior e inferior.

 

 

Figura 9. Tamaños del efecto medios para las categorías de las variables
moderadoras en el volumen nuclear en la zona próxima a la vena central.

 

CONCLUSIONES

 

En este trabajo se presentan los resultados de un  estudio meta-analítico que integra cinco estudios experimentales en los que se registran los cambios producidos en el volumen nuclear de los hepatocitos como resultado de la inducción de algún tipo de estrés. Estos cinco experimentos se llevaron a cabo en Cuba entre los años 1987 y 1996 y es el resultado de una búsqueda exhaustiva, no solo nacional sino también internacional, en ese período de tiempo. Los resultados alcanzados nos permiten alcanzar varias conclusiones y recomendaciones.

La zona que muestra una respuesta más evidente a las diferentes condiciones de estrés es la zona media, ubicada entre el espacio porta y la vena central del lobulillo hepático clásico de los animales de experimentación estudiados. En consecuencia, sugerimos la realización de las lecturas en esta zona en los experimentos de esta índole.

Ese efecto consiste en una disminución del volumen nuclear de los hepatocitos como consecuencia  lógica del daño a que es sometido el órgano debido a la condición de estrés y a su posible respuesta proliferativa.

 El grado en que se manifiesta la respuesta ante el estrés depende del tipo de estrés inducido y del tipo de fármaco. En concreto, es mayor la respuesta ante fármaco que ante hepatectomía y a su vez, dentro de los fármacos empleados, el fenobarbital produce las reducciones del volumen nuclear más drásticas. Por tanto, si pretendemos diseñar experimentos para estudiar el efecto o reacción antiestrés es sugerente el empleo de modelos que utilicen el fenobarbital.

Otro factor influyente en los resultados ha sido la fórmula empleada por los investigadores para calcular el volumen nuclear. En este sentido, recomendamos el uso de la fórmula de Palkovit, ya que es más sensible para detectar los cambios inducidos por el estrés.

 

BIBLIOGRAFÍA

 

Correspondencia: Dr. Pedro A. Díaz Rojas. Escuela Nacional de Salud Pública. Calle I 202, CP 10400. Vedado. Ciudad habana. Correo electrónico: pdiaz@infomed.sld.cu