Facultad de Ciencias Médicas "Mariana Grajales Coello" Holguín.
Acción del aceite ozonizado sobre el proceso inflamatorio en heridas de piel de animales de experimentación.
Action of ozonized oil upon the inflamatory process of the skin wounds in laboratory animal
Ana del Rosario Barroetabeña Reyes1, Alejandro Sánchez Anta2, Juan Guerra Miranda3.
1
Especialista de Primer Grado en Histología.Máster en medicina Natural y Tradicional
2
Especilista de Segundo Grado en Histología Máster en Pedagogía
3 Lic en Biología. Máster en Biología.Máster en Medicina natural
y Tradicional
RESUMEN
Realizamos un estudio experimental, el mismo se efectuó en la Facultad de Ciencias Médicas “Mariana Grajales Coello” de Holguín en Marzo de 1997 se utilizó una muestra de 120 ratones isogénicos, línea BALK-C, machos. Se dividieron en 4 grupos de 30 ratones cada uno determinándose 3 grupos controles y uno experimental. Se le realizó herida perforante en el pabellón auricular, los grupos controles fueron, uno sin curar, uno curado con aceite de girasol (vehículo del producto a investigar), un grupo control positivo en el cual los animales se curaron con factor de crecimiento epidérmico y al grupo experimental se le aplicó el aceite ozonizado, las curas se realizaron 2 veces al día. Se realizó estudio cualitativo y cuantitativo.
Las lecturas para el estudio de la densidad de neutrófilos se realizaron en la zona adyacente a la herida, superficie interna, haciéndose 3 mensuraciones en tres cortes de cada muestra utilizando el COMSDI-PLUS.
Los datos primarios se procesaron por el sistema estadístico SYSTAT, obteniéndose como resultado que la densidad de neutrófilos fue mayor en el grupo experimental, no existe diferencia significativa en las primeras 48 horas entre los grupos de estudio , la densidad de neutrófilos mantiene valores altos en el grupo experimental en el 3ro y 4to
Palabras claves: Neutrófilos, Cicatrización, aceite ozonizado
ABSTRACT
An experimental study was carried out in Mariana Grajales Coello School Holguin city in March 1997. A one hundred and twenty isogenic male mice sample the type Balck C was used for this research.
The sample was divided into four groups having thirty mice each one.An experimental group and three control ones were determinate.
For the study a stabbing wound was performed in each mouse external ears and one of the groups was not healed,another one healed with sunflawer oil (product to be search) and the other positive control group the mice were healed with the epidermic grouth factor, ozonized oil was administrered to be experimental group.In oll cases the wounds were dressed twice a days.
A qualitative and quantitative study was conducted.The readings for the study of neuttophil density were corried on the wourd´s adyacent zone,internal surface.
The COMSDI PLUS was used to perform three mesures in three cuts of each sample.
The primary data were processed by the systat statistic system, and it was show that the neuttrophil density was higher in the experimental group than the control ones,also that three was no significant difference in the first 48 hours among the study groups,on the third and the fourth days the neutrophil remaired with high volues in the experimental group.
Key words: neutrophils, cicatrization, ozonized oil
El ozono existe en la tierra desde los inicios de la vida sobre su superficie. Su nombre proviene del griego “ozein” que significa “oloroso” debido a su peculiar olor, lo que fue reportado desde 1785 por el fìsico alemàn Martinus van Marum, aunque se reconoce a Cristian Friedrich Shönbein como el que diò nombre al gas en 1840.
La primera unidad para la generación del ozono fue desarrollada por el ingeniero Werner von Siemens, permitiendo los primeros ensayos bacteriològicos sobre gérmenes patógenos por Kleinman quién además probó la influencia de ese gas sobre las mucosas de animales y humanos. Desde 1872 Sir Benjamin Collins Brodie dió a conocer la naturaleza química del ozono.
Es una variedad alotrópica del oxígeno y su molécula se compone de tres átomos de oxígeno que forman un triángulo isósceles. Entre sus principales propiedades esta su gran reactividad , su color azul, su olor característico.
Alrededor de 1873 Fox descubrió la capacidad del ozono para eliminar microorganismos. A partir de esto, las primeras aplicaciones del mismo con objetivos socialmente útiles se desarrollaron a fines del siglo pasado cuando se hicieron los primeros trabajos para el tratamiento del agua con vistas a su desinfección, conducidos por el doctor Müller.
En el campo de la medicina, es en la Primera Guerra Mundial donde Albert Wolff lo utilizó por primera vez con fines terapéuticos, para la curación de heridas. En esa misma época, por sus propiedades desodorantes se utilizó en el exámen de pacientes con cáncer rectal y ginecológico.
Posteriormente no se continuo desarrollando el uso terapéutico del gas debido a diversos factores, entre los que se encontraban la falta de un equipamiento adecuado para aplicarlo, el descubrimiento de nuevas drogas antibióticas (sulfonamidas y penicilinas) y la falta de confianza en su utilidad. Es en la década del 50 cuando el doctor Joachim Hansler en Alemania desarrolla el primer ozonizador con fines terapeúticos lo que permitió que progresivamente se fuera extendiendo la ozonoterapia 1
Al ser el ozono un gas extremadamente reactivo, se postula que sus principales mecanismos de acciòn se relacionan con la generaciòn de productos secundarios, al reaccionar de forma selectiva con los dobles enlaces carbono-carbono de los componentes orgànicos, principalmente àcidos grasos poliinsaturados presentes en el plasma y en las membranas celulares. A partir de la reacciòn del ozono con dichos compuestos se generan los llamados ozónidos y los peròxidos orgànicos los que en cantidades adecuadas y controladas ejercen diferentes acciones biológicas que le confieren una serie de propiedades terapéuticas. 2-4
El uso del ozono ha resultado ser un tema controvertido ya que por un lado se reconoce en diversas publicaciones que es un importante contaminante ambiental, con potente poder oxidante y capacidad de producir efectos adversos para la salud, tal como se ha referido, cuando se pone en contacto con la vías aéreas tanto de animales como de humanos, causando inflamación en los tejidos pulmonares con posterior fibrosis 5-7.
Unido a ello y en base a sus propiedades se ha demostrado de forma convincente que utilizando la vía adecuada para su administración y mediante dosis controladas es capaz de producir efectos beneficiosos en mùltiples enfermedades sin reacciones adversas, 8-12 e incluso hay trabajos que reportan ausencia de toxicidad del ozono empleado bajo dichas condiciones 13
En general se acepta que el ozono puede constituir un procedimiento terapéutico que estimula los mecanismos defensivos naturales del organismo con los consiguientes beneficios para su estado de salud, siempre que se emplee por la vía y en dosis adecuadas 14
Se han desarrollado hasta el momento diferentes investigaciones relacionadas con las reacciones biológicas del ozono y a partir de estas con sus propiedades terapéuticas. Las propiedades germicidas de este gas han sido reconocidas desde los inicios de las investigaciones sobre el mismo y han conllevado para que se emplee para la desinfección del agua, aplicación que se ha extendido en los últimos años en diversos países incluido el nuestro 15-19. De manera específica se ha demostrado que el ozono es capaz de inactivar diferentes tipos de gèrmenes tales como, virus, 20 bacterias, tanto gram positivas como gram negativas 21-22 y hongos 23.
Se ha planteado que el ozono es un regulador metabólico que tiene como acción importante mejorar el metabolismo del oxígeno con una consiguiente mejoría de la circulación sanguínea debido a que mejora las propiedades serológicas de la sangre y por tanto su circulaciòn por los capilares, activa el metabolismo de los eritrocitos incrementando la velocidad de la glicolisis en ellos e influyendo sobre la cadena respiratoria mitocondrial 24, 14. De manera general mejora el transporte y utilizaciòn del oxìgeno en los tejidos, 25-26 por lo cual se ha empleado en el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central teniendo presente la alta necesidad de oxìgeno necesaria en el tejido nervioso, 9-11 así como en procesos como la diabetes y otras enfermedades relacionadas con alteraciones de la circulación sanguínea . 8
Gran parte de las propiedades terapèuticas del ozono son debidas a su capacidad de modular el estres oxidativo biològico y las respuestas inmunològicas del organismo. I. Alvarez V, 2 sostiene que la ozonoterapia es una terapia alternativa porque estimula las enzimas pertenecientes al sistema antioxidante del organismo. Actualmente se reconoce que un estres oxidativo moderado induce las defensas antioxidantes enzimàticas, por lo que se ha señalado al precondicionamiento oxidativo como un mecanismo capaz de explicar las acciones farmacològicas del ozono, en aquellas enfermedades mediadas por especies reactivas del oxìgeno 27. Otros autores han demostrado la eficacia del ozono frente a agresiones de tipo oxidativo con tetracloruro de carbono, lo que explica a través del llamado “precondicionamiento oxidativo” que estimula los sistemas antioxidantes endogènos y protege a las cèlulas contra los daños producidos por las especies reactivas del oxìgeno 28-32.
Con relaciòn a las acciones del ozono como inmunomodulador V.Bocci 33 sostiene que este gas es capaz de actuar como inductor de citoquinas tales como, el interferón, el factor de necrosis tumoral, el factor estimulador de colonia granulocito-macrófago y el factor de crecimiento transformante. Se ha comprobado tambièn que el ozono actúa sobre la proliferación y la infiltración linfocitaria 34-35 y sobre la síntesis de inmunoglobulinas 36.
Además de todo lo anterior, se ha postulado que el uso del ozono provoca la liberación de autacoides por el organismo 37-38.
Entre las aplicaciones del ozono existe un número de ellas que se relacionan con su acción favorecedora del proceso de reparación de tejidos en diferentes órganos y regiones del cuerpo, entre ellos estómago, duodeno 39 y miembros inferiores 40. Por existir en nuestra Facultad un grupo de estudios de cicatrización y aprovechando las posibilidades que nos brinda el sistema morfométrico computarizado decidimos estudiar la acción del Oleozón sobre la cicatrización.
En estos momentos en nuestro país existe una gran experiencia sobre las acciones biológicas y las propiedades terapéuticas del ozono, producto de diversos trabajos desarrollados en animales de laboratorio, así como a partir de estudios clìnicos en humanos 41.
Una de las formas más empleadas ha sido el aceite ozonizado, para lo cual en Cuba se comprobó la factibilidad de sustituir el aceite de oliva empleado en otros paìses por aceite de girasol 42 obteniéndose el producto conocido como Oleozón, sobre el cual se han realizado pruebas de mutagenicidad, 43 toxicidad dèrmica 44 y genotoxicidad, 45 con resultados negativos que han avalado su empleo en pacientes portadores de diversas enfermedades tales como, herpes simple, 46 piodermitis, 47 onicomicosis y otras micosis superficiales, 48 sin que se apreciaran reacciones adversas al producto.
Se han realizado varios estudios preclìnicos en animales de experimentaciòn sobre las propiedades y acciones biològicas del Oleozòn 49-51 y como se refirió se ha utilizado en diversas afecciones dermatológicas en pacientes.
OBJETIVOS
GENERAL
Contribuir al conocimiento del proceso de cicatrización en heridas de piel curados con aceite ozonizado.
Valorar la secuencia y duración del proceso de cicatrización durante los días que duró la experiencia, en los diferentes grupos de estudio.
Determinar la densidad de neutrófilos en la zona adyacente a la herida producida en los diferentes grupos de estudio, durante los 5 primeros días.
Comparar los resultados entre los diferentes grupos objeto de estudio.
Realizamos un estudio experimental, el mismo se efectuó en la Facultad de Ciencias Médicas “Mariana Grajales Coello” de Holguín en Marzo de 1997, se utilizó una muestra de 120 ratones isogénicos línea BALK-C machos con un peso promedio entre 25 y 30 gramos, que se mantuvieron por un período de 15 días a temperatura controlada, régimen de luz oscuridad estable y dieta a libre acceso, atendidos por personal especializado del Vivario de la Institución.
Se dividieron en 4 grupos, de 30 ratones cada uno, determinándose 3 grupos controles y uno experimental. Se le realizó a cada animal una herida perforante en el pabellón auricular de aproximadamente 1mm de diámetro. Los grupos fueron: un grupo control sin curar, control curado con aceite de girasol (vehículo del producto a investigar), control positivo en el cual los animales se curaron con factor de crecimiento epidérmico y al grupo experimental al que se le aplicó el aceite ozonizado, estas curas se realizaron 2 veces al día durante los 30 días que duro la experiencia.
La primera muestra se tomo a partir de las 24 horas después de haberse realizado la herida y el resto al 2do, 3ro, 5to, 7mo, 10mo, 15, 12, 28 y 30 días posterior a la lesión (3 animales por grupo sacrificados por dislocación cervical).
Para el estudio cualitativo de la cicatrización se utilizaron las muestras de todos los días teniendo en cuenta los siguiente indicadores: proporción de células, reepitelización de los bordes, formación de la queratina y cambios en el tejido conectivo. Para el estudio de la fase aguda de la inflamación se utilizaron las muestras hasta el 5to día de la experiencia.
Las muestras fueron fijadas en formalina neutra tamponada por 48 horas y procesadas por la técnica clásica de la inclusión en parafina, se realizaron cortes de aproximadamente 6-8 micrómetros en un micrótomo de deslizamiento horizontal y se colorearon con hematoxilina y eosina bajo control de Ph.
Las lecturas para el estudio de la densidad de neutrófilos se realizaron en la zona adyacente a la herida, superficie interna, haciéndose 3 mensuraciones en tres cortes de cada muestra utilizando para ello el sistema morfométrico computarizado (COMSDI Plus) con tarjeta digitalizadora, con monitor multisincrónico Emerson que recoge las imagénes a través de un microscopio Olympus.
A los datos primarios se le realizó la determinación del valor promedio, máximo, mínimo, desviación standar, índice de correlación, así como análisis de varianza para difinir diferencias entre las medias de los grupos por horas y ploteo de los datos utilizando el paquete estadístico Systat. Versión 5.0 para Windows 52. Los resultados se muestran en gráficos y cuadros.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En el estudio histológico cualitativo del proceso de reparación de los tejidos a nivel de la herida experimental producida en los grupos de estudio se observó a las 24 horas en el tejido de todo el pabellón auricular la aparición de congestión vascular, dada esta por la presencia de vasos sanguíneos con gran cantidad de hematies y/o leucocitos en su interior, así como cambios en las caracterísiticas de las células endoteliales, pues sus núcleos se tornaron ovales y de coloración más clara que lo habitual de una célula endotelial en reposo.
En el mismo tiempo, es decir, a las 24 horas se observaron en los 4 grupos de estudio abundantes leucocitos polimorfonucleares en el tejido conectivo adyacente a la zona de la herida, sitio donde alcanzaron grandes proporciones. Se observó que los leucocitos migraron en grandes cantidades hacia los bordes de la herida para organizar a este nivel la barrera leucocitaria defensiva.
Un comportamiento similar a los polimorfonucleares, aunque un tiempo posterior tuvieron los leucocitos mononucleares.
Inicialmente se observó en los grupos de estudio que algunas células epidérmicas adyacentes al borde de la herida sufrieron degeneración, pero ya a las 48 horas se pudo apreciar claramente el inicio del proceso de reepitelización de los bordes de la herida.
El proceso fue avanzando desde ambas superficies lesionadas hacia la zona central del pabellón auricular ocupada por el cartílago hasta que alrededor de las 72 horas ya había ocurrido la fusión de ambos brotes epiteliales en los animales tanto de los grupos controles como los curados con aceite ozonizado y factor de crecimiento.
El epitelio de nueva formación de las dos superficies, que inicialmente poseia una sola capa de células se fue estratificando apareciendo ya a las 72 horas en todos los grupos una capa superficial de células aplanadas, en las células se comenzaron a apreciar gránulos a partir del 5to día.
Aproximadamente a las 48 horas comienza a observarse la queratina en la superficie del epitelio que cubrió el borde de la herida en ambas superficies, inicialmente la queratina es inmadura o paraqueratina, pero ya a los 10 días para todos los grupos es madura u ortoqueratina.
El tejido epitelial de nueva formación a nivel del borde de la herida aumenta progresivamente de grosor, superando en todos los grupos al grosor del epitelio caracterísitico del tejido no lesionado. Llama la atención que el engrosamiento del epitelio, tanto del borde de la herida como en las zonas adyacentes fue mayor en el grupo curado con aceite ozonizado, en comparación con los grupos controles, aunque en etapas posteriores dicha característica epitelial va recobrando la normalidad.
Simultaneamente con los aspectos descritos sobre el desarrollo del proceso inflamatorio inicial de la cicatrización y a la reparación epitelial, en el tejido conectivo ocurren cambios importantes, inicialmente desde las 24 horas se aprecia en los grupos una disminución considerable de la intensidad de coloración de dicho tejido, esto representa fundamentalmente la dispersión de la sustancia intercelular por el aumento de la cantidad de líquido en los espacios extracelulares (edema). Posteriormente después del 7mo día en este tejido conectivo comienza a aumentar en forma considerable la cantidad de células fibroblásticas, cuyos núcleos inicialmente se observan dispuestos desordenamente, pero luego se orientan en sentido longitudinal a la superficie epitelial.
A partir del 10mo día en todos los grupos comienza a avanzar un nuevo tejido conectivo desarrollado entre la línea de sección del cartílago y el epitelio de nueva formación en el borde de la herida. A los 21 días de evolución de la herida en los grupos se aprecia crecimiento del tejido cartilaginoso seccionado.
Por la valoración cualitativa anterior podemos plantear que la utilización del aceite ozonizado para la cura local de heridas de piel no modifica la secuencia general de fenómenos que se producen durante la cicatrización de dicha lesiones.
En relación al proceso inflamatorio inicial de la cicatrización se pudo apreciar al comparar lo ocurrido en los grupos estudiados, que no se modificó en cuanto a secuencia de acontecimientos, sin embargo en cuanto a la intensidad fue superior en los tejidos del grupo de animales curados con el aceite ozonizado.
Al realizar el estudio cuantitativo de la densidad de neutrófilos en nuestra experiencia observamos que en el grupo de animales sin curar los valores de la densidad de neutrófilos se mantienen por encima de la media (2,3) para luego descender por debajo alrededor del 3er día. (Gráfico 1).
En el gráfico 2 que refleja la densidad de neutrófilos en heridas curadas con aceite de girasol se mantiene por encima de la media (3,3) las primeras 72 horas para descender a partir de aquí.
En el gráfico 3 el comportamiento de la densidad en heridas curadas con factor de crecimiento epidérmico, se mantiene por encima de la media (1, 4) en las primeras 72 horas para luego descender por debajo de la misma.
En el gráfico 4 el comportamiento de la densidad de neutrófilos en heridas curadas con aceite ozonizado se mantiene por encima de la media (3, 6) las primeras 48 horas para luego mantenerse oscilando a nivel de la media y descender alrededor de las 72 horas.
Al comparar estos resultados podemos significar que la densidad de neutrófilos es superior en las primeras 24 horas en el grupo curado con aceite ozonizado (5, 7), sin embargo se observa un descenso brusco desde las 24 horas alcanzado la media alrededor de las 48 horas, mientras que en el resto de los grupos es menos intenso el descenso en los cuales las cifras de la densidad de neutrófilos se mantienen por encima de las medias y descienden a las 72 horas hasta el final de la experiencia (gráficos 1, 2, 3, 4).
No obstante, el comportamiento de la curva de la fase aguda del proceso inflamatorio en los 4 grupos de estudio es similar.
Según se refiere en la bibliografía revisada, en humanos ha sido establecido que cortos períodos de exposición al ozono por vía inhalatoria producen aumento de las células y los mediadores de la inflamación junto a otros efectos y que en los fluidos obtenidos mediante lavado broncoalveolar en humanos expuestos al ozono por vía respiratoria muestran un crecimiento en el infiltrado de neutrófilos. 53
Junto a ello se ha reportado que el daño que causa el gas cuando es inhalado esta relacionado con la liberación de ácido araquidónico de la membrana celular, lo que condiciona una elevación en los niveles de leucotrienos que son iniciadores de la quimiotaxis, razón por la cual los neutrófilos son atraídos hacia el tejido, aunque el empleo de la vía cutánea no esta referida como dañina para la aplicación del ozono y existen estudios que demuestran la inocuidad del oleozón en ensayos preclínicos de irritabilidad dérmica y oftálmica, 44 estudios de toxicidad aguda y ensayos de mutagenicidad teratogenecidad, 43 nuestros resultados apoyan la necesidad de su utilización en dosis adecuada y controlada, con la base apropiada y por una vía no dañina para el organismo.
Para comprobar la existencia o no de significación estadística entre los grupos de estudio, a los datos obtenidos se le realizó un análisis de varianza. Pudimos apreciar que a las 24 y 48 horas no existe significación entre la medias de todos los grupos con una p-0. 109 y p-0. 484 respectivamente lo cual coincide con el comportamiento observado y analizado en los gráficos (1,2,3,4) Cuadros (1,2). No ocurre así a partir de las 72 horas donde si apreciamos una significación a favor del grupo experimental, cuadro (2), para una p-0. 004 y p-0. 014 respectivamente, es decir que hay una mayor densidad de neutróflilos en este grupo de estudio.
A pesar que la densidad es mayor en el grupo experimental debemos tener en cuenta que puede que influya también el vehículo utilizado en nuestra experiencia, grupo donde se obtuvo una media de 3.8, alta en comparación con las medias de los grupos sin curar y curado con factor de crecimiento epidérmico.
En las condiciones de nuestro estudio el aceite ozonizado no modifica la secuencia de acontecimientos de la cicatrización en piel.
El aceite ozonizado provoca un incremento de la densidad media de neutrófilos en las heridas de los animales estudiados.
La densidad de neutrófilos mantiene valores más altos en el grupo curado con aceite ozonizado en el 3ro y 4to día.
Continuar este estudio con otros parámetros como son estudio de las células cebadas, y de los fibroblastos.
Correspondencia: Ana del Rosario Barroetabeña Reyes, Paz #57 altos % Prado y Colón, Vista Alegre. Holguin, Email: ana.r@cristal.hlg.sld.cu