Hospital "Vladimir Ilich Lenin" de Holguín.
Morfometría de la neoplasia intraepitelial cervical. Caracterización en biopsias por ponche Hospital "V. I. Lenin" 1997.
Cervical Intraepithelial Neoplasia Morphometry. Punch biopsies characterization. " V. I. Lenin" Hospital, 1997.
Tania Ochoa Calvi*, Mercedes Seguí Sánchez**, Pedro A. Díaz Rojas***.
* Especialista de 1er. Grado en Anatomía Patológica.
** Especialista de 2o. Grado en Anatomía Patológica. Profesor Auxiliar. FCM "Mariana Grajales Coello"
*** Especialista de 2o. Grado en Histología. Profesor Auxiliar. FCM "Mariana Grajales Coello"
Presentado en el II Congreso Virtual Hispanoamericano de Anatomía Patológica, Ciudad Real, España, 1998.
RESUMEN
Se realiza un estudio observacional, en el cual se aplica la morfometría microscópica a una muestra constituída por 20 biopsias por ponche de cervix uterino, diagnosticadas como Neoplasia Intraepitelial Cervical ( N.I.C.), en el Servicio de Anatomía Patológica del Hospital Provincial Docente "V.I. Lenin", las cuales fueron distribuídas en grupos de cinco casos en corres- pondencia con el grado de la misma. En cada grupo se determinaron los si- guientes indicadores morfométricos: volumen nuclear, frecuencia de perfiles mitóticos, densidad de perfiles nucleares y densidad poblacional de células pleomórficas, utilizando el software COMSDI PLUS versión 3.0 (Computer Assisted Morphostereologic System Using Digital Image). Se determinó el valor promedio y la desviación estándar de cada indicador, aplicándose el análisis de varianza (ANOVA) y la prueba HSD de Tukey, el test de diferen- cia entre medias y el test de proporciones para establecer diferencias en- tre grupos, seleccion ndose un nivel de significación estadística de p ó 0.05.Como resultados se obtuvieron que a medida que se agrava la N.I.C. aumentan los valores del volumen nuclear, la frecuencia de perfiles mi- tóticos y el número de células pleomórficas, disminuyendo a su vez la densidad de perfiles nucleares.
Palabras claves: Morfometría, Neoplasia Intraepitelial Cervical.
ABSTRACT
An observational study, in which microscopic morphometry is applied, is carried out in a sample composed of 20 uterine cervix punch biopsy, diagnosed as Cervical Intraepithelial Neoplasia (CIN), in the Pathological Anatomy Service of " "V.I.Lenin" Provincial Teaching Hospital of Holguin, which were distributed in accordance to their phase. In each group, the following morphometric indicators were determined: nuclear volume, mitotic profiles frecquency, nuclear profiles density and population density of pleomorphic cells, by COMSDI PLUS (Computer Assisted Morpho-stereologic System Using Digital Image) software version 3.0.
Median value and standard deviation of each indicator were determined, applying variance analysis (ANOVA) and the Tukey's HSD test, difference between media and ratio test so as to stablish differences among groups, choosing a statisticall significant level of pó 0.05. As a result, as ICN worsens, nuclear volume values, mitotic profiles frecquency and pleomorphic cells number are increased, meanwhile nuclear profiles density decreases.
Key words: Morphometry, Cervical Intraepithelial Neoplasia.
INTRODUCCION
La lucha contra el cáncer constituye desde hace muchos años uno de los problemas fundamentales de la Medicina, que atañe no solo a los oncólogos, investigadores y médicos generales, sino también a toda la población; por lo tanto es razonable acoger con interés cualquier camino que suponga una lucha contra los tumores malignos (1).
El cáncer de cervix uterino constituye un problema de salud a nivel mundial y su frecuencia solo es sobrepasada por el cáncer de mama (2).
En nuestro país representa desde 1970 el 10% de todos los casos nuevos de neoplasia maligna en la mujer. Aunque las tasas de incidencia han dis- minuido de 41.3 por 100,000 en 1970 a 37.8 por 100,000 en 1990, la mor- talidad por este tumor no ha cambiado en los últimos 10 años, a pesar que desde 1967 el Ministerio de Salud Pública de Cuba desarrolla un programa nacional para la detección precoz del mismo, el cual constituye un eslabón fundamental para la disminución de la mortalidad por neoplasia maligna prevista en los objetivos, propósitos y directrices de la Salud Pública cubana para el año 2000 (1,3-6).
En la actualidad, casi todos los científicos del mundo interesados en el estudio del cáncer de cuello uterino aceptan que su diagnóstico precoz constituye un problema de importancia práctica y social, que permite lograr el mantenimiento de la salud de la mujer y su plena incorporación a la sociedad (1).
Como resultado de investigaciones sobre la historia natural de esta afec- ción en los últimos años, se han señalado numerosos factores de riesgo relacionados con la misma, tales como el déficit de vitaminas C y D, el uso de anticonceptivos orales, la multiparidad, la promiscuidad, el comienzo temprano de las relaciones sexuales, etc (3,7,8).
También se ha demostrado una fuerte asociación causal entre esta neoplasia y algunos tipos de virus del papiloma humano, así como con la presencia de lesiones preinvasoras a nivel del cervix como son las displasias que asien- tan en su epitelio (9-13).
Uno de los adelantos más importantes en el diagnóstico precoz y el tra- tamiento del cáncer de cuello uterino ha sido conocer su origen a partir de estas lesiones precursoras, donde se destaca por su frecuencia la Neoplasia Intraepitelial Cervical ( N.I.C.).
En 1973 Richart introdujo el concepto de Neoplasia Intraepitelial Cervical, considerando que esta enfermedad es única desde sus comienzos y aunque un número de ellas puede regresar sin necesidad de tratamiento, en otros casos ir progresando gradualmente hasta convertirse en un carcinoma invansor. La mayor parte de los carcinomas cervicales son el estadío final de un conjun- to de alteraciones epiteliales progresivamente más atípicas, en las que un estadío da lugar al siguiente de manera imperceptible (13-17).
La primera y aparentemente más temprana alteración es la aparición de cé- lulas atípicas en la capa basal del epitelio escamoso, lo que inicialmente se denominó hiperplasia de células basales, más tarde displasia leve y en la actualidad NIC I; la presencia de estos cambios atípicos en las dos ter- ceras partes de la capa epitelial constituye la NIC II o displasia moderada y la etapa siguiente, en la cual existe una transformación de casi todas o todas las células epiteliales en células neoplásicas sin invasión del es- troma subyacente es denominada NIC III, esta categoría incluye tanto la displasia severa como el carcinoma in situ,los cuales se clasifican en el mismo grupo ya que en ocasiones resulta prácticamente imposible establecer diferencias histológicas entre ambos (1,3,13-17).
La Neoplasia Intraepitelial Cervical es una afección ginecológica que apa- rece con relativa frecuencia; en la literatura revisada se reporta su apa- rición en el 5.5% de mujeres entre 20 y 29 años de edad y en el 2.6% de mujeres de 50 a 59 años (7,18) y si bien su diagnóstico histológico uti- lizando las técnicas habituales es válido en la mayoría de los casos, con- sideramos que el mismo puede ser perfeccionado con la aplicación de técni- cas morfométricas que permiten una valoración más objetiva de los cambios morfológicos encontrados (19,20).
El empleo de estas técnicas ha demostrado su gran utilidad en el estudio de numerosas enfermedades de origen neoplásico y de otra índole, tanto en ani- males de experimentación como en el organismo humano (21-24). En los últi- mos años la incorporación de sistemas computadorizados con digitalización de imágenes ha permitido un desarrollo acelerado y novedoso en las inves- tigaciones de este tipo (20,25-30).
Debido a la frecuencia de la Neoplasia Intraepitelial Cervical en nuestro medio y su importancia en el diagnóstico precoz del cáncer cérvico-uterino, así como la posibilidad de acoplar nuestros microscópios al sistema morfo- métrico computadorizado COMSDI PLUS (Computer Assisted Morphometric System Using Digital Image), nos sentimos motivado a realizar este trabajo, el cual nos permitir emitir un diagnóstico anatomopatológico más preciso de esta afección mediante la aplicación de indicadores morfométricos en su estudio.
METODO
Nuestro trabajo constituye un estudio observacional, en el cual seaplica la morfometría microscópica a una muestra constituída por 20 biopsias por pon- che de cervix uterino, diagnosticadas como Neoplasia Intraepitelial Cervi- cal (NIC), en el Servicio de Anatomía Patológica del Hospital Provincial Docente "V.I.Lenin"; estableciéndose como requisitos de inclusión la ade- cuada calidad de las láminas histológicas y la presencia en los cortes estudiados de la unión escamocolumnar, las mismas fueron distribuídas en grupos de 5 casos en correspondencia con el grado de la NIC.
GRUPO 1 : NIC I (Displasia leve)
GRUPO 2 : NIC II (Displasia moderada)
GRUPO 3 : NIC III (Displasia severa)
GRUPO 4 : Carcinoma in situ.
En cada caso se obtuvieron los cortes histológicos de aproximadamente 6 a 8 micrómetros, los cuales fueron procesados con la técnica de inclusión en parafina y coloreadas con la tinción de Hematoxilina y Eosina. En cada cor- te se estudiaron 10 campos, en aquellos casos en que la lesión era pequeña se estudiaron todos los campos posibles, realizándose las mediciones que a continuación señalamos mediante el sistema morfométrico COMSDI PLUS (Computer Assisted Morpho-stereologic System Using Digital Image) (31), soportado en una microcomputadora IBM (USA,1985) con tarjeta digitalizadora Eye Graber (USA,1990) acoplada a un monitor multisincrónico Emerson (SubCorea,1990) que recoge las imágenes a través de un microscopio Olympus (Jap¢n,1985), con cámara de televisión Koyo (Japon,1990), procediéndose a determinar los siguientes indicadores mediante un mouse Genius (Taiwan, 1990):
- Volumen nuclear (Vn): con un aumento de 100x y previo reticulado de la pantalla a una distancia de 10 æm se midieron todos los diámetros mayores y menores de los núcleos cortados por la línea horizontal, procediéndose pos- teriormente al cálculo del volumen nuclear absoluto utilizando la fórmula de Palkovits II (32) :
V = 1.04 p (ab) Ö(ab)
Siendo a = diámetro mayor b = diámetro menor
- Frecuencia de perfiles mitóticos (Fpm) : se obtuvo calculando el área total de la pantalla (20,939 æmý), la cual se reticuló a 20 æm,escogiéndose como selector los dos cuadros centrales que representaron un área de 800 æmý, se contaron las mitosis en todos los campos hasta llegar a 10 (cuando fue posible) en toda la pantalla y se sumaron, se contaron los núcleos en el selector y se sumaron ; posteriormente se aplicó la fórmula siguiente (33):
Qmit x As
Fpm = ----------------
Qnuc x At
Donde Qmit = perfiles mitóticos
Qnuc = perfiles nucleares
As = área del selector
At = á rea total de la pantalla
- Densidad de perfiles nucleares (Dpn): para conocer este indicador solo fue necesario contar el total de núcleos encontrados dentro del área del selector (33).
- Densidad poblacional de células pleomórficas (Dcp): este indicador se determinó mediante el cálculo del factor de forma (Ff) (34), el cual se obtuvo contorneando los núcleos observados en la pantalla cortados por la línea horizontal de la retícula a una distancia de 10 æm , determin ndose posteriormente la población de células con Ff> 0.5 y la población de células con Ffó 0.5.
Se determinó el valor promedio y la desviación est ndar de las variables estudiadas, aplicándose el análisis de varianza (ANOVA) y la prueba de HSD de Tukey, el test de diferencia entre medias y el test de proporciones para definir diferencias entre grupos. En todos los casos el nivel de significa- ción estadística fue de ó 0.05.
El procesamiento estadístico de los datos primarios se realizó mediante el paquete estadístico SYSTAT versión 3.0 (35).
ANALISIS Y DISCUSION DE LOS RESULTADOS
La aplicación de técnicas morfométricas en el estudio de la Neoplasia In- traepitelial Cervical nos brinda la oportunidad de realizar una caracteri- zación más objetiva de las variaciones celulares que se producen en sus diferentes estadíos.
Entre estos cambios celulares atípicos cobra notable significación la valo- ración de las características nucleares, tales como núcleos aumentados de tamaño, irregulares e hipercromáticos con la presencia de un número varia- ble de mitosis (36).
Diversos autores han señalado la utilidad de la cuantificación del volumen nuclear en el estudio de diversas lesiones incluyendo las de cuello uterino (19,37-40). En 1937 Strodtbeck realizó una distinción entre el carcinoma de células escamosas y el epitelio cervical normal utilizando este indicador.
En 1956 Foraken y Reagan realizaron un estudio bidimensional del volumen nuclear en áreas de metaplasia, hiperplasia atípica y carcinoma in situ, demostrándo diferencias en los valores del mismo en estas lesiones (19).
Otros autores han señalado además su utilidad como indicador en el pro- nóstico de diferentes tipos de afecciones malignas planteándose que el aumento en su valor se encuentra en relación con el grado de agresividad de la lesión dado que refleja el aumento de la actividad metabólica celular (37-45).
Los resultados obtenidos en nuestro trabajo con respecto a este indicador se muestran en el Cuadro 1 . En el mismo observamos los valores medios de volumen nuclear (Vn) obteniédo en cada uno de los grupos estudiados,ponién- dose en evidencia que el valor de este indicador aumenta a medida que se agrava la lesión; los menores valores estuvieron en los grupos 1 (50.730 37.754) y 2 (91.640 ± 79.529) y los mayores en los grupos 3 (242.714 ± 189.091) y 4 (231.407 ± 151.077).
Según los resultados del ANOVA con la prueba HSD de Tukey (Cuadro 2), hubo diferencias significativas en los grupos 1 y 2 con respecto a los grupos 3 y 4. Además, si bien el valor medio del volumen nuclear en el grupo 3 fue mayor que en el grupo 4, al realizar la comparación entre ambos grupos encontramos que no existieron diferencias significativas entre ambos va- lores.
El hecho de que los mayores valores de Vn se observen en los grupos 3 y 4 se encuentra en estrecha relación con la presencia de la anaplasia, que desde el punto de vista cualitativo podemos encontrar tanto en la displasia severa como en el carcinoma in situ, donde pueden observarse células con núcleos desproporcionadamente grandes con marcada alteración de la relación núcleo-citoplasma, así como la presencia de células tumorales gigantes con núcleos polimorfos voluminosos (15,46).
La densidad de perfiles nucleares (Dpn) es un indicador morfométrico que posibilita cuantificar la población celular en una lesión determinada, y en nuestro estudio nos permitió valorar la diferenciación de la población celular en cada grado de NIC, si tenemos en cuenta que el epitelio cervical se caracteriza por presentar una gran celularidad con la presencia de nú- cleos redondeados u ovales de pequeño tamaño (47).
El valor medio de la densidad de perfiles nucleares (Dpn) en los diferentes grupos de estudio disminuyó gradualmente a medida que avanzó la lesión (Cuadro #3). Al realizar el análisis comparativo de los resultados entre los grupos (Cuadro 4), observamos que existen diferencias significativas entre los grupos 1, 2 y 3 y al igual que en el caso del volumen nuclear no hubo diferencias significativas entre los grupos 3 y 4. Estos resultados nos hablan a favor de una mayor diferenciación celular a nivel de las lesiones iniciales en relación con los grados m s avanzados de la afección.
Uno de los par metros de importancia característico de la displasia lo constituye la presencia de im genes de mitosis. En la mucosa cervical nor- mal las mismas únicamente se observan en la capa basal, pero en el epitelio cervical displ sico suelen advertirse a niveles medios incluso en los pla- nos superficiales, apareciendo en todo el espesor del epitelio. El aumento del número de mitosis pone de manifiesto la actividad proliferativa celular y a menudo se utiliza como parámetro en la valoración del nivel de agre- sividad de una lesión tumoral (44,48-51).
En los valores medios de la frecuencia de perfiles mitóticos (Fpm) encon- trados en nuestro trabajo, se pone en evidencia claramente que a medida que se agrava la NIC aumenta el valor de este indicador, alcanzando el valor más alto en el carcinoma in situ en correspondencia con la anaplasia que histológicamente caracteriza esta lesión, donde podemos encontrar la pre- sencia y aumento del número de mitosis (46) (Cuadro 5).
Al realizar la comparación de los resultados obtenidos entre los diferentes grupos (Cuadro 6), observamos que existieron diferencias altamente signi- ficativas entre los grupos 1 y 2 con respecto a los grupos 3 y 4; signi- ficativas entre estos dos últimos y entre los grupos 1 y 2 no hubo dife- rencias.
En los distintos grados de NIC encontramos un grado variable de pleomor- fismo nuclear con variaciones en el tamaño y forma del núcleo.
La valoración histológica del pleomorfismo, desde el punto de vista cua- litativo, ha demostrado tener limitaciones por incidir en la misma el factor subjetivo del observador (49,52). La aplicación del factor de forma (Ff) en la cuantificación de esta alteración celular ha permitido una valoración más objetiva de la misma (48).
En nuestro trabajo la determinación de la densidad de células pleomórficas la realizamos mediante el cálculo del factor de forma. En el Cuadro 7 se muestran los valores medios obtenidos en este indicador, siendo el mismo de 0.34 ± 0.12 para la población más pleomórfica (Ff<0.5) y de 0.70 ± 0.10 para la menos pleomórfica (Ff>0.5). Al aplicar el test de diferencia entre medias para comparar ambos grupos de población celular pleomórfica, obser- vamos que existen diferencias significativas entre ambos resultados, por lo que se comprueba que el nivel establecido del factor de forma para clasi- ficar ambas poblaciones celulares fue seleccionado con calidad.
La distribución porcentual de la densidad de población de células pleo- mórficas (Dcp), según resultados del factor de forma en cada uno de los grupos estudiados, refleja que el por ciento de células con mayor pleomor- fismo nuclear aumentó progresivamente en relación con el grado de la NIC, correspondiendo el mayor por ciento al grupo 4 o carcinoma in situ, grupo donde también encontramos el por ciento más bajo de población celular menos pleomórfica (Cuadro 8).
Para comprobar la significación estadística de estos resultados aplicamos el test de proporciones (Cuadro 9), observando que no existió diferencia significativa entre los grupos 1 y 2, existiendo de forma significativa en el resto de los grupos y altamente significativa al comparar el grupo 4 con el resto. El hecho de que este indicador alcance sus valores más significa- tivos en el carcinoma in situ se encuentra en estrecha relación con la anaplasia y el pleomorfismo que caracteriza histológicamente a esta lesión y por consiguiente, con la disminución de la diferenciación celular de la misma (46).
Para finalizar queremos llamar la atención acerca de los resultados obte- nidos en la comparación de los diferentes indicadores morfométricos utili- zados en nuestra investigación, específicamente entre los grupos 3 y 4. Así vemos que no existen entre ellos diferencias significativas en relación con el volumen nuclear y densidad de perfiles mitóticos, siendo significativa y altamente significativa en relación con la frecuencia de perfiles mitóticos y densidad poblacional de células pleomórficas con Ff<0.5 respectivamente y a favor del grupo 4.
Esto nos indica que la diferenciación de las variaciones celulares es difí- cil aún mediante el estudio cuantitativo de las mismas en los grupos 3(dis- plasia severa) y 4 (carcinoma in situ), por lo que consideramos se debe se- guir profundizando en el estudio de aquellos indicadores que en nuestro es- tudio demostraron tener utilidad en este sentido.
Cuadro 1. Valores medios de volumen nuclear (Vn).
GRUPOS X DE
1 50.730 37.754
2 91.640 79.529
3 242.714 189.091
4 232.407 151.077
Fuente : Datos del autor.
Cuadro 2. Comparación de los resultados del volumen nuclear entre los diferentes grupos mediante la prueba HSD de Tukey. Resultados de la significación estadística.
GRUPOS 1 2 3 4
1 1.000
2 0.007 1.000
3 0.000 0.000 1.000
4 0.000 0.000 0.794 1.000
ANALISIS DE VARIANZA
Valor de F = 121.997 Probabilidad = 0.000
Fuente: Procesamiento estadístico.
Cuadro 3. Valores medios de la densidad de perfiles nucleares (Dpn).
GRUPOS X DE
1 0.00276 0.00073
2 0.00195 0.00059
3 0.00110 0.00027
4 0.00123 0.00038
Fuente: Datos del autor
Cuadro 4. Comparación de los resultados de la densidad de perfiles nucleares entre los diferentes grupos mediante la prueba HSD de Tukey. Resultados de la significación estadística.
GRUPOS 1 2 3 4
1 1.00000
2 0.00017 1.00000
3 0.00014 0.00014 1.00000
4 0.00014 0.00016 0.74435 1.00000
ANALISIS DE VARIANZA
Valor de F = 50.514 Probabilidad = 0.000
Fuente: Datos del autor
Cuadro 5. Valores medios de la frecuencia de perfiles mitóticos (Fpm).
GRUPOS X DE
1 4.692 2.027
2 7.696 4.322
3 19.991 11.593
4 27.033 10.571
Fuente: Datos del autor.
Cuadro 6. Comparación de los resultados de la frecuencia de perfiles mitóticos entre los diferentes grupos mediante la prueba HSD de Tukey. Resultados de la significación estadística.
GRUPOS 1 2 3 4
1 1.000
2 0.766 1.000
3 0.000 0.000 1.000
4 0.000 0.000 0.022 1.000
ANALISIS DE VARIANZA
Valor de F = 30.303 Probabilidad = 0.000
Fuente: Procesamiento estadístico.
Cuadro 7. Valores medios de densidad poblacional de células pleomórficas (Dcp).
Factor de forma X DE
< 0.50 0.34 0.12
> 0.50 0.70 0.10
Fuente: Datos del autor. Test de diferencia entre medias
T = 68.49 p < 0.01
Cuadro 8. Distribución porcentual de densidad de población de células pleomórficas (Dcp) según resultados del factor de forma (Ff) en los diferentes grupos.
<0.50 >0.05
GRUPOS Dcp % Dcp %
1 39 14.18 236 85.02
2 33 15.71 177 84.29
3 38 18.27 170 81.73
4 73 30.80 164 69.24
Fuente: Datos del autor.
Cuadro 9. Comparación de los resultados de la distribución de poblaciones celulares pleomórficas en los diferentes grupos mediante el test de proporciones (Z/P)*
GRUPOS 1 2 3
1 -
2 - 0.85
N.S.
3 - 3.17 - 2.38 -
0.001 0.05
4 - 10.64 - 9.98 - 7.98
0.001 0.001 0.001
Fuente: Datos del autor. * Valores de la distribución normal de Z y su correspondiente
probabilidad.
CONCLUSIONES
1. Existe correspondencia entre el aumento del volumen nuclear y el grado de severidad de la NIC.
2. La densidad de perfiles nucleares disminuye gradualmente con la progresión de la lesión, por lo que la población y diferenciación celular es mayor en los estadíos iniciales acorde a las características del epitelio cervical.
3. En la medida que se agrava la NIC aumenta la frecuencia de perfiles mitóticos y el número de células pleomórficas.
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Mercedes Seguí Sánchez. Facultad de Ciencias Médicas. Avenida Lenin No. 4. Holguín. 80100. Cuba. Fax 468137. Correo Electrónico: mercedes@cristal.hlg.sld.cu