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Correo Científico Médico de Holguín 1997;1(4)

Trabajo  Original

Facultad de Ciencias Médicas. Holguín.

Influencia de algunas condiciones empleadas en el mantenimiento post fusión de células hibridas secretoras de anticuerpos monoclonales.

Pablo Bahr Valcarcel¹, Aida Pino Bermúdez², Luis A. Escalona³ y Carmén I. López Damas⁴.

¹ Lic. en Bioquímica. Profesor Asistente de la Facultad de Ciencias del Instituto Superior Pedagógico de Holguín.
² Lic. en Microbiología. Profesor Instructor de la Facultad de Ciencias Médicas de Holguín.
³ Lic.en Matemática. Profesor Asistente de la Facultad de Ciencias del Instituto Superior Pedagógico de Holguín.
⁴ Técnica de Microbiología. Instituto Provincial de Higiene y Epidemiología de Holguin.

RESUMEN

Las células híbridas generadas en la fusión de linfocitos esplénicos de un raton Balb/c con mielomas murinos X63 fueron utilizadas para el estudio de la influencia de algunas condiciones relacionadas con el mantenimiento de los cultivos post-fusión en el crecimiento de las colonias de clones secretores de anticuerpos monoclonales. Empleando medio de cultivo RPMI-1640 suplementado con suero equino fueron ensayadas como variables diferentes concentraciones de suero en el medio, presencia de capas alimentadoras de células de exudado peritoneal de ratones normales y tiempo de adición del medio selectivo HAT a las colonias en crecimiento. Los resultados obtenidos se evaluaron por el número y tamaño de las colonias, así como su producción de inmunoglobulinas de forma inespecífica utilizando métodos ELISA, y fueron analizados y procesados estadísticamente. Se comprobó que una concentración de suero equino como suplemento del medio a un 10%, el uso de capas alimentadoras y la adición de medio selectivo HAT a las 24 horas de realizada la fusión constituyen las mejores condiciones para el mantenimiento post-fusión de las células híbridas.

Palabras claves: Células cultivadas, hibridomas.

INTRODUCCIÓN

La obtención de células híbridas productoras de anticuerpos monoclonales por fusión es un proceso muy sencillo y que se verifica al azar. Al término del mismo los híbridos formados deben ser seleccionados y expandidos, considerándose esta segunda fase como el siguiente paso crítico después de la fusión (1). Sin embargo, inmediatamente después de fusionadas, las células se hacen crecer en microcultivos en presencia de medio HAT por varias semanas, en el cual sólo deben sobrevivir las células híbridas. La cantidad de estas colonias formadas es utilizada como parámetro de valor por los investigadores para el cálculo de la eficiencia de la fusión realizada. Las condiciones seleccionadas por el investigador para el mantenimiento de estas células post-fusión pueden ser también críticas en los resultados de los clones celulares que logren crecer y desarrollarse, y aunque muchos trabajos han sido realizados para el estudio de las mejores condiciones del evento de fusión y de la selección y clonaje de los híbridos, no se han correspondido los mismos esfuerzos al estudio del mantenimiento post-fusión, objetivo principal de este trabajo.

MÉTODO

Líneas celulares y medios empleados.

La línea celular de mieloma murino X63 Ag 8.653 del banco de laboratorio de cultivo de FCMH fue utilizada. El medio RPMI-1640 suplementado con glutamina (concentración final 6 mM), piruvato (concentración final 4 mM) y suero equino con una concentración determinada por el experimento fue empleado. No se adicionó antibiótico alguno. Para la selección de los hibridomas fue empleado medio HAT. Previo a su utilización las células de mieloma murino fueron adaptadas al crecimiento en suero equino, clonados y seleccionados los clones más sensibles al medio HAT.

Procedimiento de fusión y mantenimiento de los hibridomas.

Células de bazo de un ratón inmunizado contra Leptospira Pomona pomona y células de mieloma murino (6:1) fueron fundidas utilizando PEG 50% (v/v) según el procedimiento descrito (1). Para el estudio de la incidencia de algunas de las condiciones empleadas en el mantenimiento post-fusión de las células híbridas generadas se seleccionaron como variables la presencia de capas alimentadoras de células de exudado peritoneal de ratón en los pozos de cultivo (x1), el empleo de medio HAT suplementado con diferentes concentraciones de suero equino(x2) y el tiempo posterior a la fusión en que se comenzaba su uso (x3). Para cada una de las variables se seleccionaron valores máximos y mínimos y fueron utilizados en el diseño de ocho experimentos con un órden de montaje determinado al azar, utilizando el método estadístico factorial, según se muestra en la tabla I. Uno de ellos (experimento 6) fue repetido seis veces para posibilitar el cálculo de la desviación estándar.

Las células fusionadas se depositaron en placas de 96 pozos de acuerdo a las condiciones de cada experimento y se mantuvieron a 37ºC bajo una atmósfera de 5% de CO2. Al cabo de 7 días se añadió 80 ul a cada pozo de medio HAT. A los 14 días se clasificaron las colonias observadas en colonias de gran crecimiento y de bajo crecimiento, utilizando aproximadamente un 10% del área del pozo como criterio de clasificación, y se comenzó el testaje para su producción de inmunoglobulinas.

Para la detección de la presencia de inmunoglobulinas en los sobrenadantes de los pozos con colonias fue utilizado un sistema ELISA inespecífico. 100 ul de una dilución conteniendo 5 ug/pozo de anticuerpos de carnero antiratón fueron utilizados para el recubrimiento, y bloqueados con leche descremada los pozos. El testaje fue realizado con 100 ul de los sobrenadantes extraídos de los pozos con colonias y revelados utilizando anticuerpos antiratón conjugados con peroxidasa y ofenilendiamina como sustrato. Las incubaciones fueron realizadas a 37ºC durante 2 horas, y entre cada uno de los pasos descritos fueron lavadas las placas con PBS-Tween al 0,05%. Los resultados fueron leídos utilizando un microlector MULTISKAN.

Análisis estadístico multivariado (Método factorial).

Los resultados obtenidos fueron utilizados para el cálculo de los coeficientes del polinomio empleado como modelo del experimento:

y = b0 + b1 x1 + b2 x2 + b3 x3 + b12 x1x2 + b13 x1x3 + b23 x2x3 + b123 x1x2x3

donde x1, x2 y x3 son las variables escogidas en el diseño realizado. El estimado de la varianza del error puro fue calculado utilizando los datos obtenidos en uno de los experimentos repetido siete veces (6 grados de libertad).

RESULTADOS

Los resultados de las proporciones de pozos con colonias y su clasificación se muestran en la tabla II. El testaje de los pozos con colonias de gran crecimiento y de bajo crecimiento arrojó para ambos tipos un 10% de colonias productoras de inmunoglobulinas aproximadamente, lo que permite considerar que las condiciones estudiadas no muestran influencia directa en el crecimiento diferenciado de pozos productores y no productores. El análisis estadístico fue realizado por consiguiente para determinar las condiciones más favorables en la obtención de un alto número de colonias grandes. Los valores de los coeficientes calculados para el polinomio modelo se muestran en la tabla III. De su análisis puede determinarse que las tres variables seleccionadas muestran una importante incidencia en los resultados, aunque entre ellas las interacciones no son significativas para un 85% de grado de confianza (valores menores de los coeficientes de interacción). Los valores obtenidos de los coeficientes a partir de los datos experimentales pueden considerarse aceptables, pues son mucho mayores que la desviación estándar determinada. Despreciando la influencia de los coeficientes de interacción, el polinomio modelo queda expresado como:

y = 37.4 - 14.65 X1 - 9.23 X2 + 11.25 X3

por lo que su valor máximo estará dado para X1 con valor (-1), X2 con valor (-1) y X3 con valor (1), es decir, el empleo de capa alimentadora de células, el empleo de medio HAT suplementado con un 10% de suero equino y adicionandolo a las 24 horas después de realizada la fusión como condiciones más favorables para el crecimiento de las células híbridas secretoras de anticuerpos monoclonales. Estas condiciones no sólo son corroboradas por los resultados obtenidos en el experimento 5, sino también con los obtenidos en el experimento 4, donde con todas las condiciones contrarias fueron obtenidos los peores resultados.

Tabla I: Condiciones del mantenimiento post-fusión de las células híbridas en cada experimento.

x1: con capa alimentadora (-1) sin capa alimentadora (1)

x2: suplemento suero equino 10% (-1) suplemento suero equino 15% (1)

x3: adición de medio HAT inmediata (-1) adición de medio HAT a las 24 horas (1)

Tabla II: Proporciones de pozos y de colonias con gran crecimiento en los experimentos.

(a): No de pozos con colonias de gran crecimiento/No de pozos con colonias.

(b): Resultado promedio de seis repeticiones adicionales en estas condiciones.

Fuente: Datos del autor.

Tabla III: Coeficientes calculados a partir de los datos obtenidos para el polinomio modelo

y = b0 + b1 x1 + b2 x2 + b3 x3 + b12 x1x2 + b13 x1x3 + b23 x2x3 + b123 x1x2x3

BIBLIOGRAFÍA

1. BAHR P. 1995. Producción de clones de hibridomas secretores de anticuerpos monoclonales contra Leptospira Pomona pomona. Trabajo presentado al V Taller de Anticuerpos Monoclonales. 1995 Holguín.
2. BAZIN R, Lemieux R. Role of the macrophage-derived hybridoma growth factor in the in vitro and in vivo proliferation of newly formed B cell hybridomas. The Journal of Immunology 1987; 139(3):780-7.
3. BENNICK A. Hybridomas can succesfully be prepared from frozen/thawn spleen cells. Hybridoma 1991; 20 (6): 761-5.
4. FAVILA L, Velázquez P. Principios generales de la técnica de obtención de anticuerpos monoclonales. Salud Pública Mexico 1985; 27: 185-93.
5. KENNEY J S. Influence of adyuvants on the growth, affinity, isotype and epitope specificity of murine antibodies. J Immunol Meth 1989; 121: 157-66.
6. MICHEEL B, Scharte G. Multiple antigen injections decrease the yield of hybridomas producing monoclonal antibodies. Hybridoma 1993; 12 (3) 227-9.
7. ORLIK O. Modifications of hybridoma technology which improve the yield of monoclonal antibody producing cells. J Immunol Meth 1988; 115 (1):55.
8. PERSSON M A. Increased yield of antibody producing murine spleen cell hybridomas from fusions cultured in medium supplemented with mouse serum. J Immunol Meth 1990; 127(1): 39.
9. UNDERWOOD P, Bean P. The influence of methods of production purification and storage of monoclonal antibodies upon their observed specificities. J Immunol Meth 1985; 80: 189-97.

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