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Correo Científico Médico de Holguín 1997;1(4)

Trabajo  Original

Facultad de Ciencias Médicas de Holguín.

Estudio de la influencia del suero equino en el crecimiento de mielomas murinos.

Ivonne Díaz Triana¹, María Elisa Sondon Fernández², Pablo Bahr Valcarcel ³ y Luis A. Escalona⁴

¹ Lic. en Biología. Facultad de Ciencias Médicas de Holguín.
² Lic. en Genética. Profesor Asistente de la Facultad de Ciencias Médicas de Holguín.
³ Lic. en Bioquímica. Profesor Asistente de la Facultad de Ciencias del Instituto Superior Pedagógico de Holguín.
⁴ Lic.en Matemática. Profesor Asistente de la Facultad de Ciencias del Instituto Superior Pedagógico de Holguín.

RESUMEN

Fueron estudiadas las condiciones en que resulta más favorable la utilización del suero equino en sustitución del suero fetal bovino como aditivo para el medio de cultivo RPMI-1640 en el crecimiento de mielomas murinos X63, de amplio uso en los laboratorios de generación de hibridomas del país. En un experimento inicial se comprobó la incidencia de factores estrechamente vinculados con la acción del suero en el crecimiento celular como son las concentraciones iniciales de glutamina y de suero en el medio utilizado, la calidad y concentración inicial celular y el tiempo de colecta. Una vez detrerminadas las condiciones más favorables fue realizado un estudio cinético del crecimiento de mielomas en estas condiciones y de forma comparativa con las condiciones tradicionales en que es utilizado el suero fetal bovino. Los resultados demostraron la validez del suero equino como suplemento del medio de cultivo empleado y la estrecha relación entre la concentración de glutamina y la concentración celular inicial con la concentración de suero utilizada. Los crecimientos celulares obtenidos con suero equino alcanzan valores comparables con los obtenidos al emplear suero bovino para un tiempo de colecta entre 48 y 72 horas.

INTRODUCCIÓN

El cultivo de células de mamíferos con alta eficiencia y bajo costo es un objetivo importante en la tecnología de cultivos celulares. Uno de los principales problemas económicos es el requerimiento de un suplemento de suero fetal bovino, de alto costo, en el medio de cultivo. El suero fetal bovino se ha considerado un fluído importante para el cultivo celular por su acción promotora en el crecimiento, aunque algunos autores argumentan un posible efecto tóxico al usarse en altas concentraciones. En algunos laboratorios de Biotecnología se ha realizado la sustitución del suero fetal bovino por suero equino, de más fácil obtención y un considerable menor costo, sin embargo no se han reportado estudios referidos a las condiciones en que puede utilizarse. En este trabajo presentamos los resultados de un conjunto de experimentos dirigidos a determinar las condiciones en que resulta más favorable la utilización del suero equino como sustituto del suero fetal bovino en el suplemento de los medios utilizados en el crecimiento de líneas celulares de mamíferos.

MÉTODO

Linea celular, medios y mantenimiento de los cultivos.

La línea de mieloma murino X63 Ag 8.653 del banco del laboratorio de cultivo de la FCMH fue utilizada, y hasta el inicio de los experimentos había sido mantenida en medio suplementado con suero fetal bovino. La calidad de las células fue evaluada tomando como referencia un 75% de viabilidad al iniciar los experimentos según el conteo de vivas y muertas utilizando Tripán azul, como buena ( >75% ) y mala ( <75% ). El medio de cultivo empleado fue RPMI-164, suplementado con glutamina, piruvato y suero fetal bovino o suero equino,ambos obtenidos en el Laboratorio de Medicina Veterinaria de la provincia de Holguín, en las cantidades adecuadas según el objetivo de cada experimento. Los cultivos fueron mantenidos en frascos plásticos a 37°C y cuando se requería mantenerlos en suspensión una zaranda con movimiento de 70-80 ciclos por minuto fue utilizada. Durante el tiempo de cultivo en los experimentos no se realizó reposición alguna de medio.

Influencia del suero equino en el crecimiento celular.

La influencia del suero equino en el crecimiento de la línea celular escpgida fue estudiada en su interacción con otras variables estrechamente relacionadas con él: concentraciones iniciales de glutamina y de suero en el medio utilizado, la calidad y concentración inicial celular y el tiempo de colecta. Para cada una de las variables escogidas se seleccionaron valores máximos y mínimos, que representan límites razonables de acuerdo con las condiciones del cultivo, y fueron utilizados en el diseño de ocho experimentos con un órden de montaje determinado al azar, utilizando el método estadístico factorial fraccionario saturado en el cual, mediante el cálculo del valor de los coeficientes, se comprueba la incidencia de estas variables y el suero en el crecimiento celular. Las características de cada uno de los experimentos se muestra en la tabla I. Las células fueron mantenidas en suspensión y al término del tiempo de colecta indicado en cada caso se realizó un conteo de viabilidad utilizando Tripán azul.

Estudio cinético del crecimiento celular.

Fue analizada la cinética de crecimiento de los mielomas en las condiciones seleccionadas utilizando suero equino, y en comparación con el crecimiento utilizando suero fetal bovino. La composición de los frascos en este estudio se presenta en la tabla II. Las células fueron mantenidas en suspensión sin reposición alguna de medio y durante una semana fueron tomadas muestras diarias y determinada la concentración y viabilidad celular utilizando el conteo con Tripán azul. Con los datos de estos crecimientos fueron calculados la velocidad de crecimiento específica (u) y de muerte (Kd).

Crecimiento celular comparativo en suero fetal bovino y suero equino.

Fue realizado un experimento utilizando células en crecimiento a una concentración inicial de 2 . 10E5 cél/ml aproximadamente en dos frascos conteniendo medio suplementados con suero fetal bovino y suero equino al 10% respectivamente y 6 mM de glutamina. Las células fueron mantenidas en reposo y al cabo de las 48 horas se realizó el conteo celular.

RESULTADOS

Influencia del suero equino en el crecimiento celular.

La tabla III muestra los resultados obtenidos en el conteo y la viabilidad del crecimiento celular en cada experimento, y se refleja de manera gráfica en la figura 1. El análisis estadístico del experimento diseñado se realizó con los valores del cáculo de los coeficientes estadísticos presentados en la tabla IV. Estos valores indican que la variable determinante en el conteo celular es el tiempo de colecta, mientras que para la viabilidad lo es la cencentración celular inicial, además la concentración inicial de glutamina es una variable a tener en cuenta para ambos casos.

Los resultados obtenidos permiten apreciar un efecto compensatorio entre las concentraciones de suero y glutamina como componentes del medio de cultivo, relacionados ambos con la concentración inicial celular, lo que ha sido reportado en otros estudios sobre estas interrelaciones (2,3). Los altos crecimientos relativos se presentaron en los cultivos con bajas concentraciones iniciales celulares cuando poseen una alta concentración de suero (experimentos IV y V), y en los casos de altas concentraciones iniciales celulares cuando poseen una baja concentración de suero (experimentos I y VIII). Dentro de ellos las combinaciones alta concentración de suero-baja concentración de glutamina y baja concentración de suero-alta concentración de glutamina alcanzan los mayores valores relativos, sugiriendo así una complementación entre estas dos variables. Esto indica que en los casos en que se emplea una alta concentración celular xd puede prescindir de altas concentraciones de suero, permitiendo así mayores crecimientos al evitar la posible influencia de factores de inhibición en el suero que producen un posible efecto tóxico, como sugieren los resultados de los experimentos II, VI y VII. Estos importantes efectos han sido descritos por otros autores (1,4,5). Considerando la posibilidad de reducir la concentración inicial de suero equino empleado en el medio de cultivo y de variar la densidad inicial celular en estrecha relación con ella, se realizó un estudio cinético para determinar las mejores condiciones a emplear y el tiempo óptimo de olecta.

Estudio cinético del crecimiento celular.

Los resultados obtenidos en los conteos diarios para el crecimiento celular en cada frasco se muestran de forma normalizada en la figura 2 y los crecimientos relativos en ellos en la figura 3. Se evidencia un alto número de células vivas entre los 48 y 72 horas de iniciados los cultivos, lo que sugiere ser el tiempo idóneo para hacer la colecta pues el crecimiento se encuentra en la última etapa de su fase exponencial. Los crecimientos alcanzados indican que los valores más altos corresponden a los medios suplementados con suero bovino, aunque son aceptables y comparables los resultados para los cultivos suplementados con suero equino. En ambos casos, el suplemento con 10% de suero conduce a las mayores concentraciones celulares, sin embargo los medios suplementados al 5% muestran crecimientos relativos superiores. Las cifras de mayor viabilidad se presentan entre las 48 y 72 horas para todos los frascos, aunque los mejores resultados se obtuvieron en los medios suplementados al 10% con ambos sueros (datos no mostrados).

La variación de la velocidad de crecimiento específica se muestra en la figura 4 describiendo picos y rápidas caídas como los obtenidos por otros autores (2). Las mayores velocidades de crecimiento se alcanzaron en los cultivos con un 5% de suero, seguidos de un rápido decrecimiento. Al cabo de 60 horas la velocidad de crecimiento de los cultivos al 5% práticamente había desaparecido mientras que los suplementados al 10% presentaban aún valores adecuados. Al parecer los cultivos con 5% de suero presentan menor toxicidad en el crecimiento, aunque los factores promotores del crecimiento no logran un mantenimiento sostenido de su efecto por más de 48 horas. Se apreció en todos los casos valores de velocidad de muerte específica cercanos a 0 durante las primeras 72 horas con una tendencia al aumento a partir de las 80 horas (datos no mostrados).

Crecimiento celular comparativo en suero fetal bovino y suero equino.

El cultivo celular comparativo en condiciones de reposo fue realizado usando ambos sueros al 10% y 6 mM de glutamina y permitió obtener resultados que se reflejan en la figura 5. Los mejores resultados se aprecian en el suero bovino, aunque los valores alcanzados por el suero equino se acercan de forma significativamente a ellos.

Los resultados obtenidos en este trabajo indican que el suero equino constituye una opción válida para ser utilizado como suplemento de los medios de cultivo empleados en el crecimiento celular. Las mejores condiciones para el empleo del suero equino como sustituto del suero fetal bovino en el crecimiento son suplementándolo al 10% en combinación con una concentración inicial de glutamina de 6 mM, yutilizando una concentración inicial celular de 2 . 10E5 cel/ml aproximadamente. En estas condiciones las más altas concentraciones de células viables se obtienen entre 48 y 72 horas.

Tabla I. Principales características de los crecimientos celulares. Experimento # 1.

Fuente: Datos del autor

Tabla II. Principales características de los crecimientos celulares. Experimento # 2

Fuente: datos del autor

Tabla III. Resultados obtenidos en el conteo celular y la viabilidad. Experimento # 1.

Fuente: Datos del autor

Tabla IV. Valores obtenidos en los coeficientes estadísticos de las
variables introducidas aplicando el metodo factorial fraccionario. Experimento # 1

Fuente: Datos del autor

BIBLIOGRAFÍA

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2. DUVAL, D.../et al/Factors controlling cell proliferation and antibody production in mouse hybridoma cells. Biotechnol and Bioeng 38: 561-570,1991.
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4. LEE, G.M.../et al/ Production of monoclonal antibody using free-suspended and inmobilized hybridoma cells. Effect of serum. Biotechnol and Bioeng 38:821-830, 1991.
5. LOPEZ, R. Diseño estadístico de experimentos. Editorial Científico Técnica. La Habana, 1988.
6. MURAKAMI, H.../et al/ Physiological enhancement of immunoglobulin production of hybridomas in serum free medium. Cytotechnology 5:83-94, 1991.

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