Trabajo de revisión
Centro para la Investigación y Rehabilitación de las Ataxias Hereditarias “Carlos J. Finlay”. Departamento de Neurobiología Molecular.
Biología molecular de la enfermedad de Huntington.
Huntington’s Disease Molecular Biology.
Luis Enrique Almaguer Mederos1, Dany Cuello Almarales1, Yanetza González Zaldivar2, Edilberto Martínez Góngora3, Milena Paneque Herrera4.
1 Licenciado en Biología.
2 Licenciada en Microbiología.
3 Especialista en Neurología.
4 Licenciada en Psicología.
RESUMEN
La enfermedad de Huntington es un trastorno neurodegenerativo hereditario que se presenta por lo general en personas de mediana edad. Es progresiva y sus síntomas incluyen movimientos involuntarios de la cara y las extremidades, cambios en el estado de ánimo y una tendencia a perder la memoria. Se debe a la expansión de una secuencia repetitiva de CAG contenida en el gen IT15, que codifica para una proteína poliglutamínica con una manifiesta tendencia a formar agregados intra o peri-nucleares. El descubrimiento de la mutación causal de esta enfermedad ha hecho posible la implementación de programas para el diagnóstico molecular, presintomático y prenatal, así como un significativo avance en la comprensión de los mecanismos moleculares involucrados y la búsqueda de opciones terapéuticas. En el trabajo se realizó una revisión bibliográfica de la biología molecular de este síndrome.
Palabras clave: cuerpos de inclusión, enfermedad de Huntington, penetrancia, proteína poliglutamínica.
ABSTRACT
Huntington´s disease is a hereditary and neurodegenerative syndrome which is frequently presented in middle aged people. It is progressive and its principal symptoms include face and extremities involuntary movements , changes in mood and loss of memory due to a CAG expansion in the IT15 gene for a polyglutamine protein with a trend to aggregation. The discovery of the causal mutation makes possible the implementation of molecular, predictive and prenatal diagnosis programs, as well as a significant improvement on the molecular mechanisms understanding that are involved, and the therapeutic options. A review on the molecular biology of this disease was carried out.
Key words: inclusion bodies, Huntington´s disease; penetrance, polyglutamine protein.
INTRODUCCIÓN
La enfermedad de Huntington (EH) se ha constituido en el modelo por excelencia de enfermedades poliglutaminicas. El gen causal fue el primero del genoma humano en realizársele el mapa a través de análisis de ligamiento, y la investigación de sus fundamentos biológicos y de los complejos mecanismos moleculares subyacentes ha marcado pauta en el ámbito de la neurobiología molecular y del diagnóstico predictivo y asesoramiento genético.
De hecho, la identificación de la mutación patológica en el año 1993 abrió las puertas a la implementación de programas en varios países del mundo, destinados al diagnóstico presintomático y prenatal de individuos en riesgo para este síndrome; además hizo posible el desarrollo de modelos celulares y animales como herramientas de vital importancia para el esclarecimiento progresivo de sus bases moleculares, y para la proposición y evaluación de estrategias terapéuticas potenciales. Su naturaleza hereditaria, progresiva, invalidante y discapacitante, unido a la carencia de terapias efectivas, convierten a este síndrome, aún insuficientemente explorado en nuestro país, en un problema de salud con importantes implicaciones económicas y sociales.
DESARROLLO
Síndrome clínico de la enfermedad de Huntington.
El síndrome clínico es delineado en 1872 por George Huntington, quien escribiera “Esta enfermedad tiene tres marcadas peculiaridades: su carácter hereditario, una tendencia a la locura y al suicidio, se manifiesta como una enfermedad grave solamente en la edad adulta” 1.
De hecho, la enfermedad de Huntington es una afección neurodegenerativa, progresiva, y hereditaria con un patrón de herencia autosómico dominante, que provoca trastornos en el control motor y emocional, la capacidad cognitiva, y un movimiento clásicamente coreico 2. La corea, proveniente del griego y que significa “bailar”, es un movimiento involuntario alrededor de múltiples articulaciones.
La distonía es prominente en los estadios avanzados de la enfermedad. Generalmente la bradicinesia coexiste con la corea 3 y, en los casos juveniles, se puede observar un estado parkisoniano con un significativo enlentecimiento de los movimientos oculares, y en algunos de estos casos, temblores y mioclonus 2.
La pérdida del control sobre los movimientos voluntarios contribuye de manera importante a la incapacidad física en los pacientes con la enfermedad de Huntington. Esto progresa a lo largo del curso de la enfermedad hasta que provoca una incapacidad total para ejecutar cualquier movimiento que el individuo se haya propuesto realizar. Además, en los estadios intermedios de la enfermedad es común la disfunción de la deglución y el habla, lo que conduce a una incapacidad para engullir y para comunicarse 2. Solamente ha sido descrito un caso con inicio tardío de la EH en que el síntoma inicial fue la disfagia 4.
Los trastornos psiquiátricos asociados a la EH tienen diversas presentaciones que incluyen psicosis con alucinaciones visuales (raramente), depresión, trastornos afectivos, manías, comportamiento obsesivo y agresivo, apatía, desinhibición sexual y abuso del alcohol. Todos los pacientes manifiestan trastornos cognitivos, con un más rápido declive del desempeño visuo-espacial en comparación con el verbal. También se observan trastornos de la memoria, la atención y la concentración desde las estadías iniciales de la enfermedad5.
La edad de inicio promedio de la enfermedad es de aproximadamente unos 40 años, aunque varía en un amplio rango que va desde los dos hasta los 80 años de edad. Aproximadamente el 10% de las personas con la EH desarrollan síntomas antes de los 20 años de edad, y otro 10% los manifiesta después de los 60 años. A diferencia de los casos de inicio en la adultez, en los casos juveniles la rigidez y la bradicinesia dominan el cuadro neurológico en aproximadamente el 50% de los casos 2.
El gen IT15.
El gen causante de esta patología fue el primer gen humano localizado a través de análisis de ligamiento usando polimorfismos en fragmentos de restricción (RFLPS); el gen se encuentra en una región telomérica del cromosoma 4 (4p16.3) 6. Diez años después de este descubrimiento, en 1993, fue identificado el gen y la mutación patogénica que consistió en la expansión de una secuencia repetitiva de CAGS situada en el primer exón del gen IT15 7.
Aún no existe clara evidencia de que el progreso de la enfermedad varíe en función del número de repeticiones de CAG presentes en el gen IT15 8, 9. Típicamente, el tiempo que media entre el diagnóstico y la muerte es de unos 15 años 2. A pesar de haber sido encontrada una correlación inversa estadísticamente muy significativa entre el número de repeticiones de CAG y la edad de inicio y progresión de la enfermedad, existe una gran variabilidad en la edad de inicio independiente de la longitud del tracto de CAG, que sugiere la existencia de otros modificadores con mayor efecto en individuos con pequeño número de repeticiones de CAG 10.
Recientemente y a través de un modelo de regresión logarítmica, fue estimado que la longitud de la secuencia de CAG es responsable del 65 al 71% de la variabilidad observada en la edad de inicio11. Además, ha sido estimado que la variabilidad residual de la edad de inicio, aquella que no depende del (CAG)n, tiene una heredabilidad de aproximadamente un 40% 12. Los individuos homocigóticos parecen tener edades de inicio similares a las de los heterocigóticos, y una más acelerada progresión del síndrome clínico 13.
La secuencia repetitiva de CAG del gen IT15 es inestable durante la transmisión intergeneracional, con una marcada tendencia a expandirse 14. A través del genotipo de espermatozoides, ha sido determinado el espectro mutacional en líneas germinales del gen IT15. La frecuencia mutacional promedio fue del 48%, mientras que en aquellos individuos con al menos 50 CAGS, ésta fue del 98% 14. También ha sido bien documentado que las grandes expansiones de este gen ocurren en transmisiones paternas, no obstante, éstas pueden también ocurrir en transmisiones maternas del gen, aunque con menos frecuencia 15.
En general, han sido establecidas cuatro categorías de alelos del gen IT15 de acuerdo con su correlación fenotípica. Los alelos menores de 27 unidades de CAG son considerados normales que son transmitidos de manera más o menos estable de generación en generación; los alelos entre 27 y 35 unidades de CAG se conocen como “normales mutables”, que no causan enfermedad pero que tienen una muy alta probabilidad de expandirse al rango patológico cuando son transmitidos a la siguiente generación; los alelos entre 36 y 40 unidades de CAG son considerados como patológicos de penetrancia incompleta, mientras que los alelos con más de 40 CAGS manifiestan una penetrancia completa 16.
Un estudio más reciente utilizando una estrategia que permite la cuantificación de la tasa de progresión de la enfermedad en la población, a través de la medición del flujo mutacional, determinó que la enfermedad es un 100% penetrante en aquellos casos con 42 o más CAGS. Además, fue determinado que la tasa de aparición de nuevas mutaciones en cada generación es del 10% o más de los casos actualmente registrados 17. Basados en estos estimados ha sido recomendado que los clínicos no deben asumir que la EH es rara fuera de los pedigríes conocidos 17. Esta recomendación es apoyada también por recientes observaciones realizadas en pacientes con la EH en British Columbia 18.
Es importante notar además, que este síndrome clínico muestra heterogeneidad genética. Hasta la fecha han sido identificados tres loci responsables de la manifestación de fenotipos semejantes al característico de la EH (HDL-1, HDL-2, y HDL-3) Particularmente, los cambios genéticos en el locus HDL-1 que provocan la manifestación de este síndrome clínico consisten en varias mutaciones puntuales por lo que también muestra heterogeneidad alélica; la mutación en el locus HDL-2 (juntofilina-3) también consiste en la expansión de una secuencia repetitiva de CAG 19. Además han sido encontrados pacientes con síndromes clínicos típicos de la EH que portan alelos normales del gen IT15 y que, sin embargo, portan alelos expandidos de los genes DRPLA o TBP (SCA17) 19, 20. En añadidura, también han sido encontrados pacientes con un síndrome clínico típico de la EH que no portan mutaciones en ninguno de los loci antes mencionados, por lo que ha sido sugerido que existe aun más heterogeneidad genética para los fenotipos semejantes al de la EH 20.
La huntingtina, proteína del gen IT15.
El gen IT15 contiene un extenso marco de lectura abierto que codifica para una proteína (huntingtina-htt) de ~348 kDa, ampliamente expresada y que no muestra homología con ningún otro gen conocido. La htt es expresada en varias subpoblaciones neuronales del sistema nervioso central, así como en líneas celulares de diferentes tejidos somáticos. No hay un enriquecimiento particular de esta proteína en el estriado. Aún más, no hay alteraciones en la expresión de la proteína con la expansión poliglutamínica en pacientes EH. Luego, ni el patrón de expresión del ARNM ni el de la proteína ofrecen evidencias de las causas de la muerte neuronal selectiva en la EH 7.
Los residuos glutamínicos codificados por la secuencia repetitiva de CAG están vinculados a la formación de enlaces intra e ínter-proteícos, a través de reacciones catalizadas por transglutaminasas (TGasa) De este modo, las TGasa parecen estar relacionadas con el proceso molecular de neurodegeneración en la EH, y ha sido especulado que su actividad puede ser un factor contribuyente a la variabilidad de la edad de inicio, y que la razón (CAG)n/Actividad TGasa puede ser importante en la manifestación de la EH 21.
La htt mutada es más resistente a la proteólisis que la proteína normal 22. Varias observaciones realizadas en este sentido han dado lugar a un modelo según el cual la inhibición de la proteólisis de la htt mutada conduce a la agregación y a la toxicidad a través del secuestro de dianas importantes, incluida la htt normal 23. Esta observación fue recientemente confirmada y, además, fue demostrado que los agregados de la htt mutante secuestran htt normal y componentes de la maquinaria de tráfico celular, provocando la pérdida de la movilidad mitocondrial y eventualmente la disfunción mitocondrial 23. La htt normal parece ser un regulador transcripcional del factor neurotrófico derivado del encéfalo (BDNF), un factor producido por neuronas corticales que es necesario para la supervivencia de las neuronas estriatales del encéfalo. Este efecto beneficioso de la htt se pierde cuando la proteína está mutada, lo que resulta en una disminución de la producción del BDNF que provoca la muerte neuronal por soporte neurotrófico insuficiente de las neuronas estriatales 24.
Como estrategia alternativa para identificar productos génicos que aumenten la toxicidad de un fragmento mutante de htt, Willingham et al. 25 desarrollaron pesquisajes genómicos en levaduras. De 4 850 mutantes haploides que contenían delecciones de genes no esenciales, fueron identificados 52 que fueron sensibles al fragmento mutado de la htt. Los genes que aumentaban la toxicidad del fragmento mutante de la htt coincidían en procesos celulares funcionalmente relacionados con la respuesta al estrés, plegamiento de proteínas, y catabolismo proteico dependiente de la ubiquitina. En este pesquisaje estuvieron sobre-representados genes con ortólogos humanos, sugiriendo que pueden haber descubierto conjuntos conservados y no sobrelapados de genes con autonomía celular y rutas relevantes para la EH.
Para examinar el rol de la agregación de proteínas poliQ en la etiología de la EH y de otras enfermedades con secuencias expandidas de CAG, Yang et al. 26 generaron agregados de péptidos poliQ simples in vitro y los introdujeron en células de mamífero en cultivo. Las células COS-7 y PC12 en cultivo rápidamente endocitaron agregados de péptidos poliQ sintetizados químicamente. Los agregados poliQ simples estuvieron localizados en el citoplasma y tuvieron poco impacto en la viabilidad celular. Sin embargo, los agregados de péptidos poliQ que contenían una señal de localización nuclear estuvieron localizados en el núcleo y provocaron una dramática muerte celular.
La localización nuclear de un agregado de un péptido poliQ corto fue tan tóxica como la de un péptido poliQ largo, dando fundamento a la idea de que la influencia de la longitud de la secuencia repetitiva en el riesgo de la enfermedad y en la edad de inicio se manifiesta al nivel de la eficiencia de la agregación. Los autores concluyeron que sus resultados dan fundamento a un rol directo para los agregados poliQ en la neurotoxicidad asociada a la EH.
Otra reciente observación que apoya la hipótesis de un rol patológico para los agregados formados por la htt mutada, proviene de estudios realizados con Rojo Congo en células HeLa transfectadas con una repetición poliglutamínica expandida (Q79) y en el modelo murino R6/2 de la EH 27. El Rojo Congo tuvo un rol protectivo contra la citotoxicidad inducida por Q79. Esta sustancia preservó la síntesis normal de proteínas y las funciones de degradación, previno la activación de las caspazas y del ATP, y disminuyó la muerte celular en un 60%. Aunque el Rojo Congo no suprimió la expresión de la Q79, si inhibió la oligomerización de los agregados poliQ e interrumpió los agregados ya formados, quizás promoviendo la eliminación de los agregados a través de una mayor accesibilidad a la maquinaria celular de degradación de proteínas.
El tratamiento del modelo murino R6/2 de la EH con Rojo Congo mostró efectos protectivos en la supervivencia, pérdida de peso, y función motora, e interrumpió e inhibió la formación de oligómeros poliQ según fue demostrado por el análisis patológico. Los autores concluyeron que la oligomerización de las poliQ expandidas juega un rol esencial en su citotoxicidad crónica, y sugirieron que la inhibición de la oligomerización proteica puede ser una estrategia terapéutica viable para enfermedades poliglutamínicas 27. Sin embargo, más recientemente y a través de una nueva técnica para evaluar el impacto de los cuerpos de inclusión en la supervivencia neuronal, fue demostrado que el riesgo de muerte de neuronas que expresaban la htt mutante fue mejor predicho por el nivel de formas difusas de la proteína mutante y por la longitud de sus expansiones poliQ. La formación de cuerpos de inclusión redujo los niveles intracelulares de htt mutante difusa e incrementó la supervivencia neuronal, indicando un efecto protectivo de los cuerpos de inclusión y sugiriendo que su formación es una respuesta adaptativa de la célula 28.
Diagnóstico presintomático y prenatal.
El diagnóstico genético predictivo de la EH se hizo posible a partir del descubrimiento de un RFLP en el brazo corto del cromosoma 4 que está ligado al locus de la EH. Este RFLP, llamado G8 o D4S10, se encuentra a 4 ó 5 centimorgans del locus de la EH, por lo que analizando muestras de ADN de individuos afectados y no afectados en una familia, puede ser determinado cual patrón del RFLP segrega con la EH y, de esta manera, dar un diagnóstico con un 95% de exactitud de sí se tiene o no el gen patológico 6.
Posteriormente fueron identificados nuevos marcadores polimórficos más cercanamente ligados al locus EH: D4S43, D4S62, D4S95. Así por ejemplo, el D4S95 es un locus altamente polimórfico que hasta el momento no ha mostrado recombinación con el locus EH, y que por tanto permite una exactitud de aproximadamente un 99% en el diagnóstico.
La identificación del gen causante de la EH permitió la realización y práctica común del diagnóstico genético de esta enfermedad, por análisis directo de la secuencia repetitiva de CAG del gen IT15 que codifica para la proteína huntingtina (htt), desde el verano de 1993.
En diciembre de 1996 fue creado, por el Colegio Americano de Genética Médica y la Sociedad Americana de Genética Humana (ACMG/ ASHG), un grupo de trabajo que se encargara de estandarizar los métodos y la terminología usada por los laboratorios clínicos para el diagnóstico genético de la EH, basados en la experiencia acumulada en esta actividad. Este grupo emitió una guía de laboratorio para el diagnóstico genético de la enfermedad de Huntington en abril de 1998, que relaciona una serie importante de recomendaciones con el propósito de optimizar este proceso 29.
El desarrollo y estandarización de estos procedimientos han impactado significativamente sobre el diagnóstico presintomático y prenatal de la EH. Una revisión de la información disponible acerca de los diagnósticos presintomáticos realizados en un periodo de diez años en el Reino Unido, reveló un total de 2 937 diagnósticos, de los cuales 2 502 (85,2%) fueron realizados por análisis directo del gen 30. Por otra parte, y de acuerdo con una evaluación de los resultados del diagnóstico presintomático de la EH en España en un período de seis años, el servicio fue solicitado por tan solo 87 individuos con antecedentes familiares de la EH.
Durante el seguimiento en esos seis años fueron detectados efectos adversos ligeros en cinco pacientes (6,8%), todos portadores de la mutación patológica, y ningún caso con reacciones catastróficas como suicidio, intento de suicidio u hospitalización por severos trastornos psiquiátricos 31. De acuerdo con una experiencia de más de diez años en cuanto al diagnóstico predictivo de la EH en dos centros italianos, ninguno de los individuos identificados como portadores del gen mutado tuvo reacciones catastróficas 32. Un resultado similar fue reportado por otro grupo italiano en 60 individuos en riesgo para la EH y en cuatro casos en riesgos para la SCA1 o la SCA3/MJD 33. Estas cifras ponen de manifiesto la importancia del contexto sociocultural para la aplicación de programas dirigidos al diagnóstico predictivo de la EH, y el gran alcance de esta tecnología, tanto en el ámbito biomédico como psicosocial.
Conclusiones
La enfermedad de Huntington es una de los síndromes clínicos causados por proteínas poliglutamínicas más ampliamente estudiadas. El descubrimiento del gen de la EH, marcó un hito en la atención médica de pacientes enfermos y familiares en riesgos. El estudio de este gen ha posibilitado la implementación de ensayos diagnósticos aplicables a pacientes, y a individuos asintomáticos en riesgo de padecer la enfermedad y que quieren conocerse condición genética. Esto también es posible para el diagnóstico prenatal. En los últimos años se han hecho avances muy significativos en la compresión de la fisiopatología molecular de la enfermedad, y existen observaciones importantes acerca de posibles alternativas terapéuticas. La búsqueda de opciones curativas, el reto principal para los investigadores especializados en esta patología, cuenta hoy en día con una base científica sólida sobre la que se gesta un desarrollo acelerado.
BIBLIOGRAFÍA
Correspondencia: Dr. Luis Enrique Almaguer Mederos. Correo electrónico: leam@cristal.hlg.sld.cu