Trabajo original
Centro de Inmunología y Biopreparados. Holguín.
Obtención de sueros hiperinmunes de origen equino antitoxina tetánica, utilizando adyuvante oleoso.
Equine hiperinmune sera tetanus toxin production using an oily adyuvant.
Antonio R. Miranda Cruz1, Rolando Sánchez Artigas2, Walter Góngora Amores3, Onelio Mulet Pupo4.
1 Lic. en Química. Investigador Agregado. Centro de Inmunología y Biopreparados. Holguín.
2 Dr. en Medicina. Especialista de Segundo Grado en Inmunología. Profesor Asistente. Centro de Inmunología y Biopreparados. Holguín.
3 Lic. en Microbiología. Centro de Inmunología y Biopreparados. Holguín.
4 Dr. en Medicina Veterinaria. Laboratorio Provincial de Veterinaria.
RESUMEN
Numerosos han sido los trabajos desarrollados con vistas a la obtención de sueros hiperinmunes heterólogos, siendo la especie equina una de las primeras en ser utilizadas. A partir de éste se han obtenido antitoxinas tetánica, anti-botulínica, anti gangrena gaseosa, antidiftérica, así como antídotos contra venenos de las serpientes corralillo, cascabel, cabeza de cobre y mocasín, utilizada por vía endovenosa. La utilidad de los preparados de inmunoglobulinas de caballo han sido de gran importancia en humanos, sin embargo es de destacar su uso como material de referencia para fabricar las vacunas cubanas (vax-Tet) y las conjugadas (DTP, DTP- Influenza, DTP-Influenza- Hepatitis B) obtenidas por técnicas de la ingeniería genética y biotecnología. Esta investigación revela la posibilidad de obtener suero equino hiperinmune específicos para la toxina Tetánica con altos títulos de anticuerpos, a partir de plasma de yeguas adultas jóvenes hiperinmunizadas, para lo cual aplicamos dos esquemas de inmunización con un mismo antígeno, uno adsorbido en Gel de Hidróxido de Aluminio (Al(OH)3) y otro con una formulación adyuvante oleosa preparada por los investigadores del laboratorio de Sueros del Cibho, obteniéndose con la fórmula desarrollada títulos cinco veces superiores, que los observados en el esquema con el antígeno adsorbido a Gel Al(OH)3. La mezcla adyuvante oleosa resultó ser inmunogénica, fluida, fácil de preparar, segura, de estabilidad adecuada, fácilmente inyectable y no produce reacciones secundarias en los receptores.
Palabras claves: Inmunoglobulinas, Anatoxina Tetánica, Adyuvante, Unidades de floculación (Lf) Unidades equivalentes de floculación (UELf).
ABSTRACT
Many works aimed to obtain hiperinmune heterologous serum have been developed, being the equine species one of the first to be used. From this serum, antivenins have been obtained tetanous, anti-botulinum, anti gangrene and also antidiphtheria toxins, as well as antidotes against poisons of the snakes use in endovenous way. The use horse inmunoglobulins preparations have been of great importance in humans, nevertheless is usefull to emphasize its use as material of reference to manufacture the Cuban vaccines (vax-Tet) and the conjugated (DTP, DTP- Influenza, DTP-INFLUENZA- Hepatitis B) obtained by techniques of the genetic engineering and biotechnology. This investigation reveals the possibility to obtain hiperinmune specific serum from horses for the Tetanus toxin with high titles of antibodies,from plasma of adult young hiperinmunized mares, for which we apply two schedules of immunization with a same antigen, one adsorb in Aluminum Hydroxide Gel (Al(OH)3) and another in a adjuvant oily fomulation prepared by the reaearchers of the Serum Laboratory of the Cibho. Using the developed formula five time finer titles were obtain than those in the plan with the adsorbed antigen to Gel Al(OH)3. The adyuvant oily mixture resulted to be immunogenic, flowed, easy to prepare, safe, of easily injection, adequate stability , without adverse reactions.
Key words: inmunoglobulins, tetanous anatoxin, adjuvants, flocculation units
INTRODUCCIÓN
En 1890 Behring y Kitasato publicaron el primer trabajo acerca de la eficacia experimental de la antitoxina equina frente a la toxina de la difteria (15). Un año después comenzó el uso clínico en humanos de estos sueros los cuales salvaron a cientos de pacientes de morir por esta enfermedad.
Numerosos han sido los trabajos desarrollados con vistas a la obtención de sueros hiperinmunes en animales, siendo los equinos los más utilizados con estos fines (1).
Del suero de equinos se han obtenido antitoxinas para el tratamiento del botulismo, la gangrena gaseosa, así como antivenenos de las serpientes corralillo, cascabel, cabeza de cobre y mocasín, utilizándose por la vía endovenosa (2, 15).
Van der Scheer y col. demostraron que la producción de IgT en caballos era diferente según el tipo de antígeno utilizado para la inmunización. Observaron que cuando se inmunizaba con antígenos como el toxoide tetánico, diftérico, antígeno de la fiebre escarlata, staphylococos, pertussis, cl. welchii, cl. oedematiens y cl. histolyticum los títulos de IgT en el suero eran elevados, esto no ocurría cuando se inmunizaban los caballos con antígeno Antineumocócico tipo I y II, Meningococo y Pasteurella.
La utilidad de los preparados de inmunoglobulinas de caballo ha sido fundamentalmente como sueros heterólogos en el humano (3), sin embargo es de destacar otros usos, como suero patrón en el control de proceso de obtención del antígeno y control del producto final de vacunas (4). Las razones mayores por las cuales los adyuvantes ejercen su actividad son: i) presentación del antígeno, definido por la apariencia física del antígeno en la vacuna; ii) captación antígeno/ adyuvante; iii) distribución (blanco de las células específicas); iiii) potenciación/ modulación inmune las cuales incluyen las actividades que regulan ambos aspectos cuantitativo y cualitativo de la respuesta inmune que esta sucediendo (19).
Los adyuvantes para vacunas aumentan la respuesta a anfígenos por: la formación de depósitos del mismo en el sitio de inoculación; estimulación de la activación de macrófagos y la proliferación de linfocitos por una amplificación no específica de señales por las Células Presentadoras de Antígeno y células Th (citoquinas); la provisión de un vehículo para el transporte del antígeno emulsionado a través del sistema linfática hasta lugares distantes, tales como nodos linfáticos y el baso, donde se establecen nuevos focos de formación de anticuerpos. La emulsión adyuvante a su vez puede diseminar en varios órganos, dependiendo de la ruta de inoculación, con el desarrollo de focos granulomatosos en lugares dístales.
Con algunas excepciones, los adyuvantes son extraños al organismo y causan reacciones.
Los antígenos adyuvados con aluminio, a pesar de los resultados contradictorios, se están utilizando universalmente como adyuvantes para las vacunas DTP. Seguida a la administración se han reportado reacciones de Hipersensibilidad de Tipo I. El más utilizado es el Gel de Hidróxido de Aluminio Al(OH)3 obtenido por la precipitación del Hidróxido de Aluminio bajo condiciones alcalinas (alum = K2Al2(SO4)4 . 24H2O): el más ampliamente utilizado en vacunas para el Homo Sapiens junto con el MF59 (emulsión de agua en aceite de escualeno). Este activa los linfocitos Th2 e induce la producción de IgE y IgG1.
Existen varias formulaciones de agua en aceite minaral: El adjuvant 65 es una marca registrada para emulsión de agua en aceite que contenga antígeno en aceite de cacahuete con Arlacel A (mannide monooleato) y monostearato de aluminio como agente emulsificante.
El Adyuvante Incompleto de Freund (IFA)compuesto por aceite de parafina (mineral) de baja graveda específica y viscosidad. Arlacel A (mannide monooleato), Drakeol 6VR, y Montanide ISA-51 son comúnmente utilizados como emulsificantes. IFA induce respuestas inmune Th2 débil. Utilizado principalmente para booster después de la inmunización con Adyuvante Completo de Freund, puede ser peligroso debido a: i) Inmediata liberación de más cantidad de vacuna emulsificada que la tolerada por las personas; ii) rompimiento de la emulsión con la liberación de todo o parte del volumen del antígeno dentro de un periodo breve de tiempo; iii) reacciones de Hipersensibilidad de Tipo I; iiii) reacciones retardadas de largo plazo, incluyendo el desarrollo de nódulos, quistes o abscesos estériles que requieren la intervención quirúrgica.
Otros adyuvantes, Marcol 52:Montanide 888 6:1 o 9:1, Montanide 80® o Marcol 82® y Span Tween Marcol (STM), han sido utilizados con el propósito de obtención de anticuerpos en animales.
MÉTODO
Antígeno Tetánico utilizado:
Vacuna Antitetánica vax-TET (Anatoxina tetánica adsorbida a Gel de Hidróxido de Aluminio, hidróxido de aluminio Al(OH)3 precipitado bajo condiciones alcalinas (alum = K2Al2(SO4)4 . 24H2O)) .
Anatoxina Tetánica estéril.
Este antígeno es producido en la Planta de Producción de DTP en del Instituto de Vacunas de Ciudad de La Habana Finlay.
Adyuvantes:
Animales: Para la obtención de los sueros hiperinmunes se utilizaron yeguas de la raza Quarter horse entre 6 y 9 años de edad, con un peso mayor de 800 Lbs, procedentes de una Granja de Mejoramiento Genético Equino en la Provincia de Holguín.
Preparación de los inóculos: Se realiza la formulación a escala de laboratorio con varias concentraciones (actividad en Lf) de antígeno (anatoxina tetánica), agregando 50% v/v de fase acuosa a 50% v/v de fase oleosa. Las Mezclas se prepararon por 10 minutos a 4ºC en un agitador mecánico (300 rpm) seguido de una homogenización por 5 min a 2000 rpm.. La calidad de la misma fue probada colocando una porción de la misma entre un portaobjeto y un cubreobjeto y examinándola bajo el microscopio, determinando el tamaño de las gotas acuosas y el grado de absorción de dicha fase en el adyuvante, la visualización de este proceso se ayudó agregando una cantidad pequeña de un tinte de acridine naranja soluble en agua a la solución tampón de fosfato.
Los ensayos de la emulsión también se probaron golpeando o dejando caer una porción de la misma en una superficie de agua fría.
Esquema de Inmunización:
El primer esquema de inmunización se realizó con volúmenes crecientes de Toxoide tetánico adsorbido con Hidróxido de Aluminio (Vacuna Antitetánica vax-TET) de 10 hasta 50 ml , con una frecuencia de 15 días de intervalo, durante un año y medio.
El segundo esquema de inmunización se realizó con la formulación diseñada por los investigadores del CIBHO, conteniendo la anatoxina tetánica. En este esquema se utilizan los animales previamente inmunizados en el esquema anterior, que no alcanzaron los títulos de anticuerpos deseados.
Las inoculaciones fueron realizadas por vía subcutánea en diferentes puntos a cada lado de la columna vertebral de los animales.
Ensayo de Floculación (Prueba de Ramon), test utilizado para medir actividad del suero antitoxina tetánica: Ensayo recomendado por disposición de la OMS (Producción y Control de la Vacuna de Tétanos), el método recomendado fue ensayado con Anatoxina Tetánica Estándar que contenía 50 Lf/ ml. (9), para lo cual se utiliza 1 ml de la mezcla de la anatoxina tetánica estándar fue preparada con diferentes cantidades de suero equino incubado en baño de agua (45oC) y observado hasta la presencia de floculación. El primer tubo que presentó floculación fue considerado para el título estimado.
Se valoran la efectividad de los inóculos y los esquemas utilizados, se comparan los resultados y se analizan datos obtenidos por otros investigadores, se recoge en tablas y se discuten los mismos, dando a conocer las conclusiones.
Resultados experimentales:
Calidad de la formulación adyuvante obtenida.
La calidad de la emulsión resultó de la visualización de gotas muy pequeñas de tamaños uniformes en la fase oleosa, utilizando este patrón observado ha permitido la reproducibilidad de la formulación.
La emulsión resultó una mezcla blanca fluida, debido a la utilización de aceite mineral ligero, que no tuvo dificultad al ser inyectada.
La formulación oleosa induce altos títulos de anticuerpos y resulta ser segura.
No se observaron reacciones sistémicas ni locales visibles en el sitio de inoculación. Los títulos de anticuerpos antianatoxina tetánica se incrementaron significativamente, en comparación con los títulos obtenidos utilizando la vacuna vax-Tet.
Los resultados con el inóculo preparado en nuestro laboratorio junto al incremento de frecuencia del esquema aplicado y de la dosis muestran inducción de una respuesta de anticuerpos entre cuatro cinco veces mayor a la obtenida con la formulación establecida por el Instituto Finlay, el adyuvante, gel de hidróxido de aluminio, que podría manejarse más fácilmente y quizás mejor tolerado por el hospedero no fue eficaz.
En la tabla 1 se muestran los resultados de los títulos de los cuatro animales utilizados en los esquemas de inmunización.
Tabla 1. Títulos de antianatoxina Tetánica alcanzado posterior a las inmunizaciones, expresados en UELf/ml.
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Animales |
Títulos de anticuerpos en LELf/ ml |
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Esquema #1 |
Esquema # 2 |
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1 |
250 |
1600 (Plasma) |
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2 |
150 |
830 (Plasma) |
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3 |
100 |
620 (Plasma) |
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4 |
100 |
500 (Plasma) |
DISCUSIÓN
Algunas especies de animales son utilizadas cuando se necesitan grandes volúmenes de antisueros, en particular para la producción comercial; los equinos, especies mayormente utilizada tienen un largo período de vida, son buenos respondedores, fáciles de manipular y pueden ser desangrados por la vena yugular (8).
El requerimiento de las facilidades y el costo del mantenimiento de animales grandes han limitado su uso principalmente para la producción comercial de antisueros. Otro factor de gran importancia en la producción de anticuerpos policlonales son el uso de adyuvantes, ya que los equinos son particularmente intolerante a los adyuvantes de base oleosa (10,11), tal como el Adyuvante Completo de Freund (18), el tipo y calidad de estos incluyendo la características de la formulación inmunógeno/ adyuvante, (emulsión, adsorción) debe tenerse en cuenta, donde además se incluye la naturaleza del inmunógeno, la ruta y el tiempo de administración, el método de colección de la sangre, estado de salud y genético del animal. Se debe destacar que la presencia de agentes infecciosos y/o de estrés pueden suprimir la respuesta inmune o reducir la cantidad de anticuerpos producidos, e incluso resultar en una respuesta no significativa.
La mayoría de los efectos secundarios indeseables por el uso de adyuvantes se manifiestan en la severidad y duración (5). Por consiguiente, debe determinarse primero que adyuvante se requiere.
Los adyuvantes inmunológicos son cualquier agente que actúa para reforzar, amplificar, acelerar, modificar, o prolongar las respuestas inmunes específicas a los antígenos de las vacunas (10,12,14). Cuando estos adyuvantes se usen debe resultar en un aumento de los niveles de anticuerpos sostenidos, los mismos actúan de diferentes maneras, pueden formar depósitos del immunógeno en el sitio de inyección que lleva a una descarga lento por un periodo de tiempo mayor, que da el estímulo sostenido al sistema inmunológico. Los adyuvantes también dosifican la liberación del immunógeno al bazo y/o a los nodos linfáticos, dónde ocurren la fase inductiva de la respuesta inmune debido a que facilita las interacciones célula-célula en la respuesta inmune, activando de manera directa o indirectamente varios tipos de células dendríticas, macrófagos y linfocitos CD4+, involucrados en la respuesta inmune; también influyen en la duración de la respuesta, en la clase y subclases de inmunoglobulinas que predominan en la respuesta frente a toxina, pudiendo influir en la avidez de los anticuerpos (6,13,16).
La mezcla del immunógeno y el adyuvante debe ser fácilmente inyectable en volúmenes pequeños y tener baja toxicidad.
Formulaciones oleosas han sido utilizadas como adyuvantes para la preparación de vacunas veterinarias, emulsiones sencillas agua en aceites basadas en el aceite de mineral (Marcol 52) y Montanide 888 como emulsificante han resultado en mezclas fluidas fáciles de preparar, seguras y de estabilidad adecuada. (8)
Para la inmunización eficaz, es deseable que la respuesta inmune conferidas por las vacunas sea fuerte y de larga duración, induciendo niveles altos de anticuerpos específicos en la mayoría los individuos vacunados.
Los resultados presentados en este trabajo muestran que la formulación oleosa utilizada cumple con las característica generales de un buen adyuvante, al utilizar en ambas experiencias el mismo inmunógeno purificado y donde demostramos que la respuesta es 6 veces mayor a la respuesta desarrollada cuando se utilizó el Hidróxido de aluminio, Vacuna (Vax TeT), no se observan reacciones indeseables y la especificidad de las reacciones encontradas aparece en tiempos semejantes al de otros autores (Comunicación personal de Cádiz). La mezcla adyuvante oleosa resultó ser inmunogénica, fluida, fácil de preparar, segura, de estabilidad adecuada, fácilmente inyectable.
CONCLUSIONES
No se observaron reacciones sistémicas ni locales visibles en el sitio de inoculación.
La formulación oleosa induce altos títulos de anticuerpos y resulta ser segura.
Los títulos de anticuerpos antianatoxina tetánica con la formulación oleosa se incrementaron significativamente en comparación con los títulos obtenidos utilizando la vacuna Vax-TeT.
BIBLIOGRAFÍA