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Correo Científico Médico de Holguín 1997;1(2)

Trabajo  Original

Departamento de Ciencias Fisiológicas, Facultad de Ciencias Médicas de Holguín.

Método Elisa para el diagnóstico rápido de la leptospirosis. Normalización y evaluación de la técnica.

Aida Pino Bermúdez¹, Alfredo Saltaren Cobas², Pablo Bahr Valcarcel³, Rolando Sánchez Artigas⁴.

¹ Lic Microbiología. Profesor Instructor. Departamento de Ciencias Morfológicas, Facultad de Ciencias Médicas de Holguín.

² Lic Microbiología. Profesor Instructor Adjunto. Laboratorio de Leptospiras, Centro Provincial de Higiene y Epidemiología, Holguín.

³ Lic Bioquímica. Profesor Asistente. Facultad de Ciencias, Instituto Superior Pedagógico de Holguín.

⁴ Médico especialista en Inmunología. Profesor Asistente. Departamento de Ciencias Fisiológicas, Facultad de Ciencias Médicas de Holguín.

RESUMEN

Se normalizó un método ELISA indirecto para el diagnóstico de la Leptospirosis humana. Fue aplicada la técnica a un foco de Leptospirosis ocurrido en el municipio Urbano Noris, lo que permitió evaluar los resultados con los obtenidos por la técnica de microaglutinación microscópica como prueba de referencia. Se comprobó estadísticamente que ambos métodos difieren en su sensibilidad.

El método inmunoenzimático resultó útil en la detección de niveles de anticuerpos en etapas tempranas de la infección en comparación con la microaglutinación, con la posibilidad de procesar gran número de muestras simultáneamente y en corto tiempo; esto sugiere su aplicabilidad en estudios microbiológicos y epidemiológicos.

Palabras clave: Leptospirosis, Diagnóstico de laboratorio, ELISA.

INTRODUCCIÓN

La Leptospirosis como problema de salud a nivel mundial ha hecho necesaria la evaluación de métodos diagnósticos sensibles y específicos para esta zoonosis, que avalados por el cuadro clínico y los antecedentes epidemiológicos, permitan establecer un diagnóstico acertado de la enfermedad.

Es conocido, sin embargo, que en el diagnóstico de laboratorio el examen directo de productos patológicos y cultivos presentan baja positividad, por ello las pruebas serológicas han sido muy utilizadas para establecer el diagnóstico , detectando niveles de anticuerpos en los pacientes de acuerdo al período evolutivo de la enfermedad, han sido utilizados diversos métodos serológicos describiéndose la microaglutinación (MAT) con antígenos vivos como prueba de referencia (1,2). En los últimos años y con el desarrollo de técnicas inmunológicas de tercera generación, diversos autores a nivel mundial han demostrado la importancia de la aplicación de métodos inmunoenzimáticos (ELISA) como un importante recurso de laboratorio en el diagnóstico de la Leptospirosis humana (3,4,5,6,7,8,9)., demostrándose sus ventajas al compararlo con la prueba clásica de MAT, teniendo en cuenta la posibilidad de detectar por este método exposiciones recientes a Leptospiras, además ha demostrado ser una técnica simple, rápida y de bajo costo que permite procesar grandes números de muestra en breve tiempo (3,4,5,6,7,8).

Teniendo en cuenta que ha sido planteado por diferentes autores la mayor sensibilidad mostrada por los métodos inmunoenzimáticos durante la primera semana de la enfermedad consideramos de vital importancia su utilización.

Esta antropozoonosis es una enfermedad endémica en nuestra provincia, con incremento de los casos registrados en los últimos años y se encuentra regularmente distribuída en el territorio afectando fundamentalmente a la población de edad laboral que por razones del desarrollo económico trabajan en zonas donde se encuentran la mayor parte de los focos de infección (10,11), razón por la cual nos propusimos contribuir al diagnóstico de esta enfermedad mediante la normalización y evaluación de un método ELISA para la detección de infecciones a Leptospiras, aplicando el mismo a una pesquisa efectuada en nuestra provincia a un foco de la enfermedad.

MÉTODO

Normalización del método ELISA.

Se normalizó un método ELISA indirecto para la detección de anticuerpos anti-leptospiras en el suero, Se establecieron las diluciones óptimas de todos los reactivos por titulación simultánea cruzada de varias diluciones del antígeno, suero y conjugado, y se seleccionaron aquellas donde se obtuvieron claras evidencias de la presencia de anticuerpos por el cambio de color observado mediante lectura visual, o sea, toda muestra cuya intensidad de color era superior a la de los controles negativos empleados.

Antígenos:

Fueron utilizados como antígenos los siguientes:

- Células íntegras. Se utilizaron cultivos de Leptospira de serovar Patoc I, procedentes del Centro Provincial de Higiene y Epidemiología de Holguín y mantenidas en medio Korthoff modificado, en el cual fue observada la presencia de 400-800 Leptospiras por campo 150x. Las células bacterianas se lavaron tres veces con solución salina al 0,85%, se centrifugaron utilizando centrífuga refrigerada a 12 000 rpm durante 20 minutos, se inactivaron con formalina al 37% y se resuspendieron finalmente en buffer de recubrimiento solución carbonato-bicarbonato de pH 9,6.

- Antígeno termorresistente (TR). Se utilizaron 250 ml de una suspensión de Leptospira interrogans, serovar canícola con 7-10 días de crecimiento en medio Korthoff modificado, las que fueron centrifugadas a 10 000 rpm durante 30 minutos y lavadas con solución salina tamponada formalinada; finalmente se colocó en baño de María a 100 grados Celsius durante 10 minutos para posibilitar la separación del antígeno termorresistente según lo descrito (12). El antígeno obtenido fue resuspendido en buffer de recubrimiento solución carbonato-bicarbonato de pH 9,6.

Conjugado: Se utilizaron antiinmunoglobulinas humanas totales conjugadas con peroxidasa, utilizando diluciones desde 1:400 hasta 1:1600.

Sueros: Se emplearon sueros previamente estudiados por microaglutinación, controles negativos y positivos comprobados clínica y serológicamente. Cada una de las muestras de suero se trabajaron por duplicado.

Las soluciones y reactivos de trabajo se elaboraron según la metodología descrita (3,4) y se utilizaron las siguientes modificaciones o variables que nos permitieron seleccionar los mejores resultados:

- Recubrimiento de las placas a diferentes temperaturas: 4 grados Celsius o 37 grados Celsius, ambas durante toda la noche.

- Fijación de las Leptospiras a la placa: utilizando glutaraldehido al 0,25 % en PBS por 7 minutos, formalina al 4 % diluída 1:10 en PBS por 30 minutos, y sin utilizar agente alguno para la fijación.

- Para el recubrimiento de Leptospiras se utilizaron tres diluciones, desde 1:3 hasta 1:18, utilizando Leptospiras íntegras lavadas o antígeno termorresistente.

El ensayo inmunoenzimático en fase sólida (ELISA) se realizó en el Laboratorio de la Facultad de Ciencias Médicas de Holguín.

Evaluación del método ELISA.

El método ELISA indirecto se evaluó con la Microaglutinación como método de referencia . Fueron estudiados un total de 67 sueros procedentes de un foco detectado en Los Naranjos, municipio Urbano Noris, fundamentalmente entre el personal directamente vinculado a las labores agrícolas durante los meses de octubre a diciembre de 1993. Se tomaron muestras de suelo al personal con antecedentes clínicos o epidemiológicos de la enfermedad, incluyendo sintomáticos, asintomáticos, así como primera y segunda muestras de suero, o sea, sueros pareados que previamente fueron procesados por la técnica de Microaglutinación microscópica en el Laboratorio de Leptospiras del Centro Provincial de Higiene y Epidemiología de Holguín, segun lo normado (2).

Los casos para nuestro estudio fueron escogidos de forma aleatoria, 56 sueros correspondían a la primera serología y 11 a la segunda, tomadas de 15 a 20 días posterior a la primera muestra. Los sueros testados correspondían a la primera muestra, segunda o ambas de un mismo caso.

Análisis estadístico. Los resultados obtenidos por el método ELISA y la MAT en la primera serología realizada a cada uno de los casos fueron analizados estadisticamente por la prueba de chi cuadrado de MacNemar con la corrección de Yates.

RESULTADOS

Normalización del método ELISA.

La técnica ELISA fue normalizada para la detección de anticuerpos anti-Leptospiras, encontrándose como temperatura óptima para el recubrimiento de las placas de poliestireno 37 grados Celsius durante toda la noche con una concentración de 400-800 Leptospiras por campo 150x, sin la utilización de agentes de fijación, una dilución para el suero de 1:10, utilizando antiinmunoglobulinas humanas totales conjugadas con peroxidasa, con mejores resultados en una dilución 1:1000.

En la tabla I se reportan los casos positivos y negativos obtenidos por ambos métodos (ELISA y MAT), en la primera y segunda serologías. De los 67 casos estudiados resultó mayor el número de casos positivos por el método ELISA que por la Microaglutinación.

De los 67 casos estudiados, 56 corresponden a la primera serología y 11 a la segunda, todos escogidos aleatoriamente. Se le aplicó análisis estadístico a los resultados de esta primera serología por ser ésta la muestra más representativa, y por la importancia para el diagnóstico precoz de las muestras tomadas en las etapas tempranas de la infección (Tabla II).

Como resultado de la segunda serología encontramos mayor positividad (11 casos) por MAT que por el método ELISA (7 casos). (Tabla I).

La tabla III reporta los casos de mayor contradicción en los resultados utilizando el método ELISA y la MAT.

Tabla I. Casos positivos y negativos obtenidos por el método Elisa y Mat
microscópica en la primera y segunda muestras de suero.

Fuente: Investigación realizada.

Tabla II. Resultados de la primera serología por el método Elisa y por Mat.

Fuente: Investigación realizada.

Tabla III. Casos de mayor contradicción en los resultados por Elisa y Mat en
la primera y segunda serologías.

Fuente: Datos del autor.

DISCUSIÓN

Normalización del método ELISA. El método inmunoenzimático ELISA es una técnica relativamente reciente y utilizada mundialmente a partir de los años 80 por diferentes autores en el diagnóstico de la Leptospirosis, empleando diferentes Métodos para su normalización en busca de mejores resultados (3,4,5,6,7,8,9,13,14,15,16). Según la bibliografía revisada, ha sido muy utilizado el método ELISA indirecto para la detección de anticuerpos en el suero de pacientes a partir del recubrimiento de placas de poliestireno, empleando diferentes variantes en la obtención y extracción de antígenos de Leptospiras (3,4,5,6,7,8,9,15,16,17). En nuestro estudio utilizamos comparativamente en el recubrimiento Leptospiras íntegras y antígeno termorresistente, sin encontrar diferencias en los resultados, con claras evidencias de los casos positivos por ambos métodos, lo que sugiere que el empleo del antígeno TR resulta ventajoso al poder ser almacenado en congelación hasta su uso en casos de un foco de Leptospirosis en que sea necesario procesar gran número de muestras. Además el empleo del antígeno evita los riesgos para el personal de laboratorio de manipular sistemáticamente Leptospiras íntegras hasta su inactivación.

La mayoría de los trabajos coinciden en la posibilidad de poder emplear anti-IgM humana, como es conocido las IgM son los anticuerpos que primero pueden ser detectados en el suero, en correspondencia con la sensibilidad mostrada por el método ELISA planteada por diferentes autores al poder detectar niveles mínimos de anticuerpos característicos de las etapas leptospirémicas de la infección, es decir, a partir del cuarto día de iniciados los síntomas. Esto resulta una de las ventajas del método si lo comparamos con otros métodos serológicos tradicionalmente empleados en el diagnóstico de la Leptospirosis y que requieren del incremento de títulos de anticuerpos en sangre para ser detectados (3,4,5,6,7,17,18).

Nuestros resultados se obtuvieron mediante lectura visual, lo que constituye una alternativa de los métodos inmunoenzimáticos utilizados incluso en países desarrollados (5,6). Sin embargo, el método admite automatización y lectura fotométrica,lo que permitiría una mayor rapidez, calidad de los resultados, así como procesar mayor volúmenes de muestra.

Evaluación del método ELISA. El método ELISA es considerado más sensible en la detección de pequeñas cantidades de anticuerpos circulantes que la MAT, incluso en individuos asintomáticos con antecedentes de exposiciones a focos de Leptospiras, lo que es probable entre los casos estudiados, por ello diversos autores sugieren el método para ser utilizado como variante en situaciones epidémicas, planteándose que el método permite constatar la correspondencia entre leptospiremia y la aparición de los anticuerpos del tipo IgM que permiten el diagnóstico precoz (4,6,7,8).

Los resultados demuestran que ambos métodos difieren con significación estadística en su sensibilidad, lo que sugiere su correspondencia con lo planteado por otros autores que han realizado estudios comparativos similares, significando las ventajas del método ELISA en cuanto a sensibilidad y especificidad (5,8,14,17).

Aunque los resultados no sean concluyentes por sólo haber estudiado 11 casos todos positivos por MAT, esto coincide con lo planteado por un autor, quien encontró en sus estudios mayor sensibilidad del ELISA en la primera semana de la enfermedad y de la Microaglutinación después de la tercera semana (5).

Correspondiendo este tiempo con la etapa en que fue tomada la segunda serología en nuestro estudio.

Si analizamos los casos en que existió mayor contradicción entre ambos métodos para la primera serología (Tabla III), constatamos que un paciente a quien se tomó muestra en la pesquisa (primer suero positivo por ELISA y negativo por MAT) ingresó 11 días después con el diagnóstico de Leptospirosis, al cual se le tomó una segunda serología que resultó positiva por ambos métodos. Esto explica la importancia del método ELISA en el diagnóstico precoz y su valor en la detección de anticuerpos circulantes en sangre, que pueden significar el aviso de un contacto con Leptospiras y conducir posteriormente al desarrollo de la enfermedad.

CONCLUSIONES

El método ELISA normalizado resulta de gran utilidad en el pesquisaje ante focos de Leptospirosis por sus ventajas en cuanto a sensibilidad, posibilidad de automatización y de procesar gran número de muestras simultáneamente y en corto tiempo.

BIBLIOGRAFÍA

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